本發(fā)明屬于肌腱干細(xì)胞誘導(dǎo)分化，具體為一種誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法。

背景技術(shù)：

1、軟骨由軟骨細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，功能是承受機(jī)械載荷，抵抗關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的壓應(yīng)力和拉應(yīng)力。由于軟骨內(nèi)幾乎無(wú)血管和神經(jīng)，一旦發(fā)生磨損或損傷，很難恢復(fù)到原有的形態(tài)或功能。軟骨缺損和損傷可引起創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重影響患者健康及生活質(zhì)量。因此，軟骨損傷修復(fù)一直是臨床面臨的難題。

2、軟骨組織工程技術(shù)為軟骨修復(fù)和再生帶來(lái)了希望。其通過(guò)支架材料的理化性質(zhì)模擬體內(nèi)微環(huán)境，結(jié)合趨化因子募集大量的種子細(xì)胞歸巢，實(shí)現(xiàn)受損部位有效及時(shí)地修復(fù)。軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程的經(jīng)典種子細(xì)胞，但是軟骨細(xì)胞來(lái)源有限且會(huì)產(chǎn)生供區(qū)損傷；干細(xì)胞逐漸成為另一種種子細(xì)胞，然而可選擇種類有限，且其體內(nèi)分化不可控，使得向軟骨細(xì)胞分化的效率低，也無(wú)法獲得令人滿意的修復(fù)效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決背景技術(shù)中提及的軟骨細(xì)胞來(lái)源有限等問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，本發(fā)明的方法能夠高效誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞，不需要添加任何細(xì)胞因子和小分子化合物誘導(dǎo)分化，降低了誘導(dǎo)分化的成本，本發(fā)明的方法操作過(guò)程簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，具有廣泛推廣應(yīng)用的潛質(zhì)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，包括如下步驟：

4、(1)制備5％-10％應(yīng)變的膠原支架，經(jīng)脫細(xì)胞處理后，得到5％-10％應(yīng)變的脫細(xì)胞膠原支架；

5、(2)將肌腱干細(xì)胞接種到步驟(1)得到的5％-10％應(yīng)變的脫細(xì)胞膠原支架上，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-20天后，檢測(cè)分化后得到的軟骨細(xì)胞。

6、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)的具體步驟為：將膠原材料采用oct包埋，并使用冰凍切片機(jī)切成切片，pbs清洗除去oct，利用多角度拉力機(jī)制備應(yīng)變?yōu)?％-10％的膠原支架，將所得的膠原支架反復(fù)凍融3-10個(gè)循環(huán)，然后放入含有dnase和rnase的pbs溶液中于35-39℃條件下進(jìn)行脫細(xì)胞處理，隨后輻照滅菌；

7、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中所述膠原材料的來(lái)源為人、牛、豬、羊、馬、狗來(lái)源的肌腱、跟腱或韌帶組織的膠原中的一種。

8、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中膠原切片的厚度為100-500μm，寬度為0.5-4cm，長(zhǎng)度為1-10cm。

9、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中通過(guò)改變多角度拉力機(jī)的參數(shù)調(diào)控膠原支架材料的應(yīng)變。

10、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的多角度拉力機(jī)的參數(shù)包括拉伸速度、拉伸模式、施加力大小。

11、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的多角度拉力機(jī)的拉伸速度為10-100mm/min，拉伸模式為循環(huán)拉伸模式，施加力為0.5-3n。

12、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的反復(fù)凍融條件為液氮處理1-3min，35-39℃的pbs中處理8-12min。

13、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(1)中所述的pbs溶液中含有200-600μg/mldnase和100-300μg/ml?rnase，脫細(xì)胞處理時(shí)間為2-8h。

14、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)中所述肌腱干細(xì)胞為人、牛、豬、羊、馬、狗、大鼠、小鼠肌腱來(lái)源的肌腱干細(xì)胞中的一種。

15、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)中所述的培養(yǎng)基為dmem、rpmi1640、f12中的一種或兩種以上的組合；培養(yǎng)基中加10％-20％的胎牛血清。

16、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)中在膠原支架上接種的肌腱干細(xì)胞密度為103-105細(xì)胞/cm2。

17、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)中培養(yǎng)條件為37℃、5％co2的條件下。

18、基于上述技術(shù)方案，進(jìn)一步地，步驟(2)中所述的檢測(cè)包括阿爾辛藍(lán)染色、番紅o染色、collagenⅱ、sox9、aggrecan基因及蛋白的表達(dá)情況。

19、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有的有益效果如下：

20、本發(fā)明的方法能夠高效誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞，不需要添加多種類細(xì)胞因子和小分子化合物誘導(dǎo)分化，降低了誘導(dǎo)分化的成本，本發(fā)明的方法操作過(guò)程簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，具有廣泛推廣應(yīng)用的潛質(zhì)。

技術(shù)特征：

1.一種誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)的具體步驟為：將膠原材料采用oct包埋，并使用冰凍切片機(jī)切成切片，pbs清洗除去oct，利用多角度拉力機(jī)制備應(yīng)變?yōu)?％-10％的膠原支架，將所得的膠原支架反復(fù)凍融3-10個(gè)循環(huán)，然后放入含有dnase和rnase的pbs溶液中于35-39℃條件下進(jìn)行脫細(xì)胞處理，隨后輻照滅菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述膠原材料的來(lái)源為人、牛、豬、羊、馬、狗來(lái)源的肌腱、跟腱或韌帶組織的膠原中的一種；膠原切片的厚度為100-500μm，寬度為0.5-4cm，長(zhǎng)度為1-10cm。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中通過(guò)改變多角度拉力機(jī)的參數(shù)調(diào)控膠原支架材料的應(yīng)變；所述的多角度拉力機(jī)的參數(shù)包括拉伸速度、拉伸模式、施加力大??；所述的多角度拉力機(jī)的拉伸速度為10-100mm/min，拉伸模式為循環(huán)拉伸模式，施加力為0.5-3n。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的反復(fù)凍融條件為液氮處理1-3min，35-39℃的pbs中處理8-12min；所述的pbs溶液中含有200-600μg/mldnase和100-300μg/mlrnase，脫細(xì)胞處理時(shí)間為2-8h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述肌腱干細(xì)胞為人、牛、豬、羊、馬、狗、大鼠、小鼠肌腱來(lái)源的肌腱干細(xì)胞中的一種；在膠原支架上接種的肌腱干細(xì)胞密度為103-105細(xì)胞/cm2。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的培養(yǎng)基為dmem、rpmi1640、f12中的一種或兩種以上的組合；培養(yǎng)基中加10％-20％的胎牛血清。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中培養(yǎng)條件為37℃、5％co2的條件下。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的檢測(cè)包括阿爾辛藍(lán)染色、番紅o染色、collagenⅱ、sox9、aggrecan基因及蛋白的表達(dá)情況。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種誘導(dǎo)肌腱干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，屬于肌腱干細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將膠原材料采用OCT包埋，并使用冰凍切片機(jī)切成切片，除去OCT，利用多角度拉力機(jī)制備應(yīng)變?yōu)?％?10％的膠原支架，將所得的膠原支架反復(fù)凍融3?10個(gè)循環(huán)，然后放入含有DNase和RNase的PBS溶液中于35?39℃條件下進(jìn)行脫細(xì)胞處理，隨后輻照滅菌；將肌腱干細(xì)胞接種到得到的5％?10％應(yīng)變的脫細(xì)胞膠原支架上，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7?20天后，檢測(cè)分化后得到的軟骨細(xì)胞。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成本低廉，無(wú)需添加任何誘導(dǎo)因子就可在體外獲得軟骨細(xì)胞，具有較好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：劉暢,孫雨龍,涂祎珺,張利
受保護(hù)的技術(shù)使用者：大連理工大學(xué)附屬中心醫(yī)院（大連市中心醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15