本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，具體涉及一種裂壺藻基礎(chǔ)培養(yǎng)基與培養(yǎng)裂壺藻生產(chǎn)dha的方法。

背景技術(shù)：

1、二十二碳六烯酸(dha,docosahexaenoic?acid)，是一種屬于ω-3脂肪酸家族的多不飽和脂肪酸，是人體中大腦、視網(wǎng)膜等器官的關(guān)鍵成分；對(duì)于嬰幼兒的視力和大腦發(fā)育尤為重要，成人也需要適量的dha來(lái)維持大腦健康和認(rèn)知功能。人體不能自行合成足夠的dha，因此必須通過(guò)飲食來(lái)攝取。dha的來(lái)源包括一些深海魚類，但是通過(guò)深海魚油提純dha產(chǎn)量少且易受季節(jié)影響，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。

2、目前，dha的生產(chǎn)大多依賴于裂壺藻(schizochytrium)的發(fā)酵生產(chǎn)。裂壺藻又稱為裂殖壺菌，屬于破囊壺菌科的一類海洋真菌。與其他微藻相比，裂壺藻具有生長(zhǎng)迅速、含油量高、易于大規(guī)模培養(yǎng)等特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)裂壺藻的發(fā)酵生產(chǎn)，獲得含有大量油脂的裂壺藻藻體，然后對(duì)其進(jìn)行破壁處理，再經(jīng)高速離心提取油脂，離心過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生占發(fā)酵液體積90％以上的廢藻液，這些廢藻液中還含有近100g/l干重的裂壺藻渣。裂壺藻渣營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，含有多糖、蛋白質(zhì)、維生素等成分，可作為飼料原料使用。cn202110180281.3公開了一種利用裂壺藻渣提高草魚的品質(zhì)的功能性飼料的配制方法，將提油后的呈碎末狀的裂壺藻渣按3-9％比例添加到飼料中，可提高草魚肌肉的dha含量和魚體的抗氧化能力，改善草魚健康狀況。cn201510476484.1公開了一種裂殖壺菌破壁細(xì)胞壁漿液在水產(chǎn)魚類苗種培育上的應(yīng)用方法，將最終經(jīng)三相離心獲得的裂壺藻廢藻液作為原料添加到魚苗飼料中，可提高魚苗平均成活率24.5-34.5％。與傳統(tǒng)的飼料相比，廢藻液作為飼料含水量過(guò)高，由于其本身已是高速離心后的副產(chǎn)物，粘稠度高，因此進(jìn)行濃縮來(lái)進(jìn)一步降低含水量，但在這個(gè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量體積的蒸餾液，其化學(xué)需氧量cod和氨氮分別達(dá)到2864.5mg/l和50mg/l，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)。每噸cod的環(huán)保處理費(fèi)用為4000-5000元，而氨氮的環(huán)保處理費(fèi)用大約是cod的4倍，處理費(fèi)用較高。因此，亟需一種裂壺藻提取油脂后的廢藻液的蒸餾液的應(yīng)用、使用裂壺藻的廢藻液蒸餾液培養(yǎng)裂壺藻生產(chǎn)dha的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、(一)要解決的技術(shù)問(wèn)題

2、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)、不足，本發(fā)明提供一種裂壺藻基礎(chǔ)培養(yǎng)基與培養(yǎng)裂壺藻生產(chǎn)dha的方法，其解決了廢藻液采用減壓蒸餾的方式進(jìn)行濃縮產(chǎn)生大量體積的蒸餾液的技術(shù)問(wèn)題。

3、(二)技術(shù)方案

4、為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明將裂壺藻廢藻液的蒸餾液按廢藻液蒸餾液與純水體積比為(20-100％):(80％-0)應(yīng)用于發(fā)酵培養(yǎng)基中，用于裂壺藻的生長(zhǎng)和油脂的積累。達(dá)到此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

5、第一方面，本發(fā)明的實(shí)施例提供一種裂壺藻基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其包括：裂壺藻提取油脂后的廢藻液經(jīng)減壓蒸餾的蒸餾液。

6、通過(guò)對(duì)裂壺藻的發(fā)酵生產(chǎn)，獲得含有大量油脂的裂壺藻藻體，然后對(duì)其進(jìn)行破壁處理，再經(jīng)高速離心提取油脂，離心過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生占發(fā)酵液體積90％以上的廢藻液。然而廢藻液作為飼料含水量過(guò)高，由于其本身已是高速離心后的副產(chǎn)物，粘稠度高，因此需要進(jìn)行濃縮來(lái)進(jìn)一步降低含水量，這個(gè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量體積的蒸餾液。發(fā)明人通過(guò)分析廢藻液的蒸餾液的具體成分發(fā)現(xiàn)，其可用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基。

7、本技術(shù)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，裂壺藻提取油脂后的廢藻液蒸餾液中含有一定量檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸成分，已有研究表明蘋果酸是裂壺藻合成dha的前體物質(zhì)；培養(yǎng)基中添加適量的檸檬酸和蘋果酸能夠明顯促進(jìn)裂壺藻對(duì)脂肪酸的合成和dha的積累。

8、可選地，裂壺藻提取油脂后的廢藻液經(jīng)減壓蒸餾的蒸餾液與純水按體積比為2-10:8-0混合配制。

9、第二方面，本發(fā)明的實(shí)施例提供一種培養(yǎng)裂壺藻生產(chǎn)dha的方法，包括以下步驟：

10、s1、培養(yǎng)基的配制

11、采用純水配制種子培養(yǎng)基；

12、向第一方面的本發(fā)明的實(shí)施例提供的裂壺藻基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，制得發(fā)酵培養(yǎng)基；

13、s2、裂壺藻發(fā)酵培養(yǎng)

14、一級(jí)種子培養(yǎng)：向種子培養(yǎng)基中接入裂壺藻甘油凍存液，接種量的體積百分含量為2-5％，在150-200rpm、25-30℃下培養(yǎng)30-48h；

15、二級(jí)種子培養(yǎng)：向種子培養(yǎng)基中接入上述一級(jí)種子液，接種量的體積百分含量為2-5％，在150-200rpm、25-30℃下培養(yǎng)24-48h；

16、發(fā)酵培養(yǎng)：將上述二級(jí)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量的體積百分含量為2-5％，在150-200rpm、25-30℃下培養(yǎng)48-72h，發(fā)酵過(guò)程中添加葡萄糖補(bǔ)料液將葡萄糖濃度控制在0-60g/l，待葡萄糖耗盡，發(fā)酵結(jié)束；

17、s3、提取發(fā)酵液中油脂。

18、可選地，s1中，所述碳源為葡萄糖，所述氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米漿、谷氨酸鈉與甘氨酸中的一種或多種，所述無(wú)機(jī)鹽包括磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鈉鹽和鉀鹽。

19、可選地，s1中，所述種子培養(yǎng)基中包括葡萄糖30-40g/l，酵母粉5-8g/l，硫酸鎂1-3g/l，磷酸二氫鉀1-3g/l，氯化鈣1-3g/l，氯化鈉5-10g/l，碳酸氫鈉2-5g/l，氯化鉀0.1-0.5g/l，ph自然；

20、所述發(fā)酵培養(yǎng)基中包括葡萄糖30-50g/l，酵母粉5-8g/l，谷氨酸鈉5-10g/l，硫酸鎂1-3g/l，磷酸二氫鉀1-3g/l，氯化鈣1-3g/l，氯化鈉5-10g/l，碳酸氫鈉2-5g/l，氯化鉀0.1-0.5g/l，ph自然。

21、可選地，所述種子培養(yǎng)基和所述裂壺藻發(fā)酵培養(yǎng)基在115-121℃滅菌15-30min冷卻至室溫后再使用。

22、可選地，所述葡萄糖補(bǔ)料液的濃度為300-500g/l，115-121℃滅菌15-30min，冷卻至室溫后再使用。

23、可選地，步驟s3中，發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液中裂壺藻藻體進(jìn)行酶法破壁處理，加入正己烷混勻后進(jìn)行離心，將油脂層進(jìn)行加熱，揮發(fā)掉正己烷后進(jìn)行稱重，直至恒重，計(jì)算發(fā)酵液中總油脂含量，通過(guò)氣相色譜測(cè)定油脂中二十二碳六烯酸(dha)的含量。

24、可選地，步驟s3包括：采用堿性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶中的一種或多種酶對(duì)發(fā)酵液中的藻體進(jìn)行破壁處理；添加量為0.5-2g/l；用ph調(diào)節(jié)劑將發(fā)酵液ph調(diào)至8.0-11.0，在攪拌轉(zhuǎn)速50-150rpm，溫度40-80℃下，破壁處理時(shí)間2-4h；離心過(guò)程中，轉(zhuǎn)速3000-6000rpm，時(shí)間3-5min。

25、可選地，裂壺藻發(fā)酵培養(yǎng)

26、一級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)：向種子培養(yǎng)基中接入裂壺藻甘油凍存液，接種量的體積百分含量為2-5％，在150-200rpm、25-30℃下培養(yǎng)30-48h；

27、二級(jí)搖瓶種子培養(yǎng)：向種子培養(yǎng)基中接入一級(jí)搖瓶種子液，接種量的體積百分含量為2-5％，在150-200rpm、25-30℃下培養(yǎng)24-48h；

28、50l發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：裝液量50-70％，接入上述二級(jí)搖瓶種子液，接種量的體積百分含量為2-5％，培養(yǎng)溫度25-30℃，初始轉(zhuǎn)速80-150rpm，通氣量為0.5-1.0vvm，ph自然，培養(yǎng)15-30h按照培養(yǎng)基初始氮源濃度補(bǔ)加氮源，通過(guò)補(bǔ)加葡萄糖控制葡萄糖濃度為0-30g/l，培養(yǎng)96-120h；

29、發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基采用蒸汽實(shí)消，115-123℃滅菌20-35min，冷卻至25-30℃。

30、本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中需定時(shí)取樣，分別測(cè)定od650、葡萄糖、谷氨酸；

31、od650通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定藻液在650nm波長(zhǎng)下的吸光值，將分光光度計(jì)調(diào)整波長(zhǎng)為650nm，預(yù)熱20min，以純水作為空白樣品進(jìn)行調(diào)零，然后測(cè)定650nm波長(zhǎng)下裂壺藻液的吸光值；若數(shù)值＞0.8，將裂壺藻液進(jìn)行稀釋后重新測(cè)定，最終結(jié)果＝測(cè)定結(jié)果×稀釋倍數(shù)；

32、葡萄糖和谷氨酸通過(guò)sba生物傳感分析儀進(jìn)行測(cè)定，使用進(jìn)樣針準(zhǔn)確吸取25μl儀器專用的50mg/dl乳酸、100mg/dl谷氨酸-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣定標(biāo)，多次進(jìn)樣測(cè)定直至儀器顯示定標(biāo)結(jié)束；待測(cè)藻液3000-5000rpm下離心2-5min，取上清液，稀釋100倍后通過(guò)進(jìn)樣針準(zhǔn)確吸取25μl進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得數(shù)值分別為藻液中谷氨酸和葡萄糖濃度，單位為g/l；

33、生物量通過(guò)干重法測(cè)定。

34、(三)有益效果

35、本發(fā)明的裂壺藻提取油脂后的廢藻液蒸餾液中含有一定量檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸成分，研究表明蘋果酸是裂壺藻合成dha的前體物質(zhì)；培養(yǎng)基中添加適量的檸檬酸和蘋果酸能夠明顯促進(jìn)裂壺藻對(duì)脂肪酸的合成和dha的積累；使用蒸餾液配制培養(yǎng)基有助于裂壺藻生物量的積累且可以在小比例上減少培養(yǎng)基成分的使用。

36、本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，減少了裂壺藻廢藻液作為廢水的排放量，實(shí)現(xiàn)廢藻液蒸餾液的循環(huán)利用，既節(jié)省了水資源，更節(jié)省了裂殖壺廢藻液再利用過(guò)程中廢水的處理費(fèi)用。

37、本發(fā)明降低生產(chǎn)成本的同時(shí)，還保證dha的質(zhì)量和產(chǎn)量，是一種綠色的生產(chǎn)工藝，有助于保護(hù)環(huán)境。