本發(fā)明涉及疫苗檢測，特別涉及一種裝甲rna標準物質(zhì)及其制備方法和應用。

背景技術：

1、西尼羅病毒引起的西尼羅熱在全球范圍內(nèi)頻繁爆發(fā)，對公共衛(wèi)生構成嚴重威脅。西尼羅病毒(west?nile?virus，wnv)屬于黃病毒科(flaviviridae)黃病毒屬(flavivirus)，是一種通過蚊蟲傳播，可感染人類、鳥類、馬以及其他哺乳動物，感染后可能出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛和腦炎等癥狀。西尼羅病毒具有廣泛的流行性和致病性。目前，針對西尼羅熱尚無特效治療方法，預防措施成為阻斷疫情傳播的關鍵。因此，開發(fā)高效快速的檢測技術是防控工作的重中之重。以pcr技術為代表的分子生物學技術具有快速、靈敏、成本低等優(yōu)勢，同時利用pcr檢測技術對檢測結果進行分子流行病學分析可以得到西尼羅病毒的宿主流行情況，有助于對西尼羅熱的流行進行防控。為了確保檢測結果的準確性和可靠性，需要在檢測中加入核酸質(zhì)控品，并對檢測流程進行嚴格的質(zhì)量控制，同時，為實現(xiàn)樣品的定量分析，對質(zhì)控品進行量值標準化是必要的，因此，研制標準物質(zhì)至關重要。

2、病毒核酸類質(zhì)控品的開發(fā)主要集中在全病毒顆粒、dna和rna以及噬菌體病毒樣顆粒(vlps)。全病毒顆粒是理想的核酸檢測標準物質(zhì)，但其制備周期長，存在生物安全風險。dna或rna核酸物質(zhì)制備簡單，精確定量，安全，便于運輸，但易降解，無法用于待檢樣品的核酸提取過程質(zhì)控。裝甲rna技術中的vlps，與天然病毒粒子相似，但無任何感染性，且高穩(wěn)定性高，是核酸檢測質(zhì)控品和標準物質(zhì)的理想選擇。裝甲rna的制備周期短，穩(wěn)定性好，對于烈性傳染性病毒、新發(fā)病毒和無法進行體外培養(yǎng)的病毒具有無可替代的優(yōu)勢。

3、因此，開發(fā)包含西尼羅病毒的裝甲rna標準物質(zhì)及其制備方法對于疫情防控至關重要。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提出一種裝甲rna標準物質(zhì)及其制備方法和應用，以提供一種具有穩(wěn)定、安全、耐核糖核酸酶且可用于西尼羅病毒檢測以及質(zhì)量控制的西尼羅病毒裝甲rna標準物質(zhì)。

2、第一方面，本發(fā)明提出一種裝甲rna標準物質(zhì)，其衣殼內(nèi)包含有靶標核酸片段序列的rna，外殼是由ms2噬菌體cp蛋白基因和ms2噬菌體a蛋白基因的原核表達產(chǎn)物自組裝的類病毒顆粒。

3、綜上，根據(jù)上述的一種裝甲rna標準物質(zhì)，通過利用噬菌體ms2衣殼蛋白能有效保護其內(nèi)部rna免受環(huán)境中的核糖核酸酶降解的特性，原核表達ms2衣殼蛋白并自組裝成內(nèi)部包裹西尼羅病毒的部分rna序列的類病毒顆粒，即裝甲rna，適用于以該序列作為檢測靶標的西尼羅熱病毒核酸檢測方法的陽性對照品及質(zhì)控品，此外，本發(fā)明制備的西尼羅病毒裝甲rna標準物質(zhì)，具備濃度高、無生物危害、性質(zhì)穩(wěn)定、均一性好等特點，便于儲存、運輸和使用，為西尼羅熱病毒檢測的rna提取及rt-pcr全過程提供有效的質(zhì)控。

4、在一些較優(yōu)的實施例中，所述靶標核酸片段序列如seq?id?no.1所示，所述ms2噬菌體cp蛋白基因的基因序列如seq?id?no.2所示，所述ms2噬菌體a蛋白基因的基因序列如seq?id?no.3所示。

5、第二方面，本發(fā)明提供一種裝甲rna標準物質(zhì)的制備方法，用于制備上述的裝甲rna標準物質(zhì)，所述制備方法包括：

6、⑴將包括ms2噬菌體cp蛋白序列、ms2噬菌體a蛋白序列和wnv的西尼羅多聚蛋白基因序列克隆于表達載體pet-28a(+)，得重組質(zhì)粒pet-ms2-wnv；

7、⑵將重組質(zhì)粒pet-ms2-wnv轉入表達菌株中，誘導表達、純化、定量后得到裝甲rna標準物質(zhì)。

8、在一些較優(yōu)的實施例中，所述步驟(1)包括：

9、根據(jù)噬菌體ms2?cp蛋白序列片段設計第一特異性擴增引物，所述第一特異性擴增引物包括引物cp-f和引物cp-r，以對噬菌體ms2?cp序列進行擴增；

10、將pcr擴增產(chǎn)物噬菌體ms2?cp基因和原核表達載體pet-28a(+)雙酶切，使用質(zhì)粒純化試劑盒純化回收目的片段后并連接，將連接質(zhì)粒轉化感受態(tài)細胞中，將菌液pcr和測序鑒定均為陽性的重組載體命名為pet-cp；

11、根據(jù)噬菌體ms2?a蛋白序列片段設計第二特異性擴增引物，所述第二特異性擴增引物包括引物a-f和引物a-r，以對噬菌體ms2?a蛋白序列進行擴增；

12、將pcr擴增產(chǎn)物噬菌體ms2?a基因和表達載體pet28a-cp雙酶切，使用質(zhì)粒純化試劑盒純化回收目的片段后并連接，將連接質(zhì)粒轉化至感受態(tài)細胞中，將菌液pcr和測序鑒定均為陽性的重組載體命名為pet-cp/a；

13、人工合成西尼羅多聚蛋白序列，并在序列5’端和3’端分別插入bamh?i和not?i酶切位點，將合成的多聚蛋白基因插入到pbluescript?ii?sk+載體中，獲得含有目的序列片段的質(zhì)粒pbsk-c；

14、將表達載體pet-cp/a和質(zhì)粒pbsk-c均使用bamh?i、not?i雙酶切，15％瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒回收pet-cp和多聚蛋白序列片段，連接后轉化至dh5α感受態(tài)細胞中，將菌液pcr和測序鑒定均為陽性的重組載體命名為pet-ms2-wnv，即裝甲rna表達載體。

15、在一些較優(yōu)的實施例中，所述步驟(2)包括：

16、將重組載體pet-ms2-wnv轉入大腸桿菌原核表達菌株bl21中，培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，分別采用20℃、25℃、30℃、35℃、37℃進行誘導表達。

17、在一些較優(yōu)的實施例中，所述步驟(2)包括：

18、將轉化了pet-ms2-wnv質(zhì)粒的生物工程菌，經(jīng)過iptg在25℃低溫誘導14h后，超聲破碎后的上清經(jīng)40％的硫酸銨沉淀，用pbs重懸得到粗制樣，過分子篩進行純化。

19、在一些較優(yōu)的實施例中，所述步驟(2)包括：

20、將純化后的樣品加入benzonase全能核酸酶至終濃度250u/ml，在37℃條件下消化8h；

21、將消化后的vlps?10倍比稀釋成10-1～10-8，提取rna后進行qrt-pcr檢測。

22、在一些較優(yōu)的實施例中，所述步驟(2)包括：

23、將經(jīng)qrt-pcr檢測的樣品使用凍干保護劑將其進行稀釋，并將其分裝到棕色旋蓋小青瓶中，半加塞后凍干；

24、直至壓蓋出箱后，加旋蓋密封，貼簽，置于-15℃以下保存。

25、在一些較優(yōu)的實施例中，所述引物cp-f的基因序列如seq?id?no.4所示，所述引物cp-r的基因序列如seq?id?no.5所示，所述引物a-f的基因序列如seq?id?no.6所示，所述引物a-r的基因序列如seq?id?no.7所示。

26、第三方面，本發(fā)明還提供一種上述的裝甲rna標準物質(zhì)在制備西尼羅病毒檢測試劑盒中的應用。

27、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

28、1、本發(fā)明通過開發(fā)了一株包含有西尼羅病毒靶標序列的裝甲rna類病毒顆粒，能將其作為西尼羅病毒檢測的陽性對照品，彌補了國內(nèi)沒有該病毒陽性對照品的困境。

29、2、本發(fā)明通過用西尼羅病毒裝甲rna類病毒顆粒制備的陽性對照品，不具有繁殖性和病毒活性，沒有任何生物安全風險。

30、3、本發(fā)明研制的裝甲rna標準物質(zhì)，其作為陽性對照品效果良好，有效拷貝數(shù)可達1.0×109copies/ml以上，遠高于傳統(tǒng)滅活病毒的陽性對照品的拷貝數(shù)。

31、4、本發(fā)明可以應用于西尼羅病毒相關生物學和疫病的研究。

32、5、本發(fā)明制備得到的裝甲rna標準物質(zhì)作為陽性對照品應用于在西尼羅病毒檢測試劑盒中，可對rna提取和rt-pcr全過程進行質(zhì)控。