本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種利用馬克斯克魯維酵母制備含哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)n-聚糖修飾結(jié)的糖蛋白的方法。

背景技術(shù)：

1、蛋白翻譯后的n-糖基化修飾，直接影響到蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。哺乳動物細(xì)胞蛋白質(zhì)n-聚糖修飾的重要特征是在n-糖鏈上同時含有唾液酸(s)和巖藻糖(f)。n-聚糖主要有雜合型或復(fù)合型糖鏈結(jié)構(gòu)，可以維持n-聚糖的構(gòu)象，保證糖蛋白與受體的結(jié)合。同時在n-聚糖末端存在的唾液酸s能促進(jìn)抗體對受體的結(jié)合力，并保護(hù)糖蛋白在血液循環(huán)中不被肝臟中的非唾液酸糖蛋白受體移除，而位于糖鏈內(nèi)部核心的巖藻糖f維持了糖蛋白的穩(wěn)定性。

2、酵母是廣泛用于重組蛋白表達(dá)的細(xì)胞工廠。酵母雖然像哺乳動物細(xì)胞一樣，屬于真核生物，存在蛋白翻譯后的n-糖基化修飾，但是酵母蛋白的天然n-糖基化修飾與哺乳動物細(xì)胞存在較大差異。早期的研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母(s.cerevisiae)和畢赤酵母(p.pastoris)，它們的高爾基體中因缺乏加工成雜合型和復(fù)合型n-聚糖的關(guān)鍵酶(α-1,2-甘露糖苷酶)，所以酵母蛋白的n-聚糖不能形成雜合型及復(fù)合型結(jié)構(gòu)；同時這些酵母蛋白還會在α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶的作用下，在n-聚糖a臂上會延伸出一條多聚甘露糖鏈，并繼續(xù)在α-1,2/3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶的作用下在主干添加分支，不僅影響到重組蛋白的功能，還會在臨床應(yīng)用中帶來免疫原性。唾液酸s和巖藻糖f是哺乳動物糖蛋白發(fā)揮重要功能n-聚糖中的糖組分，在天然酵母尚未見到能夠同時合成這兩種重要的n-聚糖糖組份的報道。因此，盡管s.cerevisiae和p.pastoris等已有了廣泛的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用，但其蛋白的n-糖基化修飾與哺乳動物細(xì)胞存在的天然差異，限制了直接應(yīng)用這些天然酵母重組表達(dá)制備類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾的糖蛋白質(zhì)。

3、如果能夠克服上述天然酵母在制備類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾糖蛋白的缺陷，獲得酵母細(xì)胞工廠用于制造含有類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖結(jié)構(gòu)的蛋白，將會具有高生產(chǎn)效率、低生產(chǎn)成本的優(yōu)勢，成為工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的核心競爭力。馬克斯克魯維酵母(k.marxianus)是一種具有工業(yè)應(yīng)用潛力的新型酵母，其不僅是食品級安全級，還具有生長快、耐高溫、高分泌力等特點(diǎn)，已作為細(xì)胞工廠高效表達(dá)了多種重組蛋白。馬克斯克魯維酵母天然存在于乳品中，與哺乳動物的長期共存，天然形成了類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾的能力，有別于已經(jīng)報道的釀酒酵母和畢赤酵母的n-聚糖的修飾途徑。本發(fā)明提供了利用馬克斯克魯維酵母制備類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾蛋白的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種制備含類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾結(jié)的糖蛋白的方法。

2、本發(fā)明提供的制備含類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾結(jié)的糖蛋白的方法，利用馬克斯克魯維酵母制備類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾蛋白，包括通過在馬克斯克魯維酵母細(xì)胞中弱化甘露糖基轉(zhuǎn)移酶mnn1的表達(dá)，促進(jìn)與哺乳動物細(xì)胞類似的n-聚糖的合成；利用馬克斯克魯維酵母制備的糖蛋白不僅具有類似哺乳動物細(xì)胞的n-聚糖結(jié)構(gòu)，同時可以含有巖藻糖f、唾液酸s，本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于含有n-聚糖修飾的蛋白制造，這些n-聚糖修飾直接影響蛋白的蛋白功能，如抗體等需要n-聚糖修飾才能發(fā)揮功能的功能蛋白。

3、具體地，以馬克斯克魯維酵母fim1作為出發(fā)菌株，利用基因組編輯技術(shù)刪除馬克斯克魯維酵母fim1基因組上的基因ura3后作為宿主菌株，重組表達(dá)n-聚糖糖蛋白；所制備的糖蛋白的n-聚糖的糖鏈具有類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖的糖鏈結(jié)構(gòu)；所述馬克斯克魯維酵母fim1保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號：cgmcc?no.10621。

4、進(jìn)一步地，在馬克斯克魯維酵母fim1敲除ura3的基礎(chǔ)上，在α-1,3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因mnn1(即kmarxianus_fim1_4846)的上游5’-utr上插入aaaaaaaaaaaaat序列(記為at序列)，以弱化α-1,3甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因mnn1的表達(dá)，提高類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖糖鏈結(jié)構(gòu)的合成。

5、本發(fā)明所述的利用馬克斯克魯維酵母制備的糖蛋白，其n-聚糖的修飾結(jié)構(gòu)具有與哺乳動物細(xì)胞蛋白n-糖基化修飾類似的特征；具體為：

6、所述的馬克斯克魯維酵母蛋白的n-聚糖結(jié)構(gòu)中存在雜合型、復(fù)合型；

7、所述的馬克斯克魯維酵母蛋白的n-聚糖結(jié)構(gòu)中有同時含有唾液酸和巖藻糖；

8、所述的馬克斯克魯維酵母蛋白的n-聚糖結(jié)構(gòu)加工程序存在與哺乳動物細(xì)胞類似的加工過程。

9、所述的重組表達(dá)的n-聚糖糖蛋白具體包括但不限于利妥昔單抗fc片段、阿魏酸酯酶等。

10、更具體地：

11、用于類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾的糖蛋白的制備方法，用馬克斯克魯維酵母fim1作為出發(fā)菌，利用基因組編輯技術(shù)，敲除馬克斯克魯維酵母fim1的ura3基因作為宿主菌株；在此基礎(chǔ)上利用基因組編輯的技術(shù)在基因kmarxianus_fim1_4846上游5’-utr上插入aaaaaaaaaaaaat序列，作為重組表達(dá)外源蛋白的宿主菌；進(jìn)一步地，馬克斯克魯維酵母菌株中引入含有n-糖基化修飾位點(diǎn)nxs/t(x為除了脯氨酸以外的任意氨基酸)的外源蛋白的編碼基因，即將含有n-糖基化修飾位點(diǎn)nxs/t的外源蛋白編碼基因克隆到馬克斯克魯維酵母重組表達(dá)載體上，表達(dá)載體包含啟動子、分泌信號肽、終止子，以及自主復(fù)制序列pkd1和篩選標(biāo)記ura3；將含有外源基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化ura3δ缺陷菌株，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；經(jīng)過通風(fēng)液體發(fā)酵，在發(fā)酵液上清中獲得分泌重組表達(dá)的外源蛋白；分泌重組表達(dá)的外源蛋白，經(jīng)過n-糖肽分析，存在雜合型、復(fù)合型的n-聚糖，同時存在含有唾液酸s和巖藻糖f的n-聚糖，這些n-聚糖結(jié)構(gòu)都與哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾的糖蛋白類似，是哺乳動物細(xì)胞n-聚糖糖蛋白的根本特征。

技術(shù)特征：

1.一種利用馬克斯克魯維酵母制備含類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾結(jié)構(gòu)的糖蛋白的方法，其特征在于，以馬克斯克魯維酵母fim1作為出發(fā)菌株，利用基因組編輯技術(shù)刪除馬克斯克魯維酵母fim1基因組上的基因ura3后作為宿主菌株，重組表達(dá)n-聚糖糖蛋白；所制備的糖蛋白的n-聚糖的糖鏈具有類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖的糖鏈結(jié)構(gòu)；所述馬克斯克魯維酵母fim1保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號：cgmcc?no.10621。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在馬克斯克魯維酵母fim1敲除ura3的基礎(chǔ)上，在kmarxianus_fim1_4846的5’-utr上插入aaaaaaaaaaaaat序列，以弱化α-1,3甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因mnn1的表達(dá)，提高類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖糖鏈結(jié)構(gòu)的合成。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述利用馬克斯克魯維酵母制備的糖蛋白，其n-聚糖的修飾結(jié)構(gòu)具有與哺乳動物細(xì)胞蛋白n-糖基化修飾類似的特征；具體為：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述重組表達(dá)的n-聚糖糖蛋白包括利妥昔單抗fc片段、阿魏酸酯酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步在馬克斯克魯維酵母菌株中引入含有n-糖基化修飾位點(diǎn)nxs/t的外源蛋白的編碼基因，即將含有n-糖基化修飾位點(diǎn)nxs/t的外源蛋白編碼基因克隆到馬克斯克魯維酵母重組表達(dá)載體上，這里x為除了脯氨酸以外的任意氨基酸；表達(dá)載體包含啟動子、分泌信號肽、終止子，以及自主復(fù)制序列pkd1和篩選標(biāo)記ura3；將含有外源基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化ura3δ缺陷菌株，獲得陽性轉(zhuǎn)化子；經(jīng)過通風(fēng)液體發(fā)酵，在發(fā)酵液上清中獲得分泌重組表達(dá)的外源蛋白；分泌重組表達(dá)的外源蛋白，經(jīng)過n-糖肽分析，存在雜合型、復(fù)合型的n-聚糖，同時存在含有唾液酸s和巖藻糖f的n-聚糖；這些n-聚糖結(jié)構(gòu)都與哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾的糖蛋白類似，是哺乳動物細(xì)胞n-聚糖糖蛋白的根本特征。

6.馬克斯克魯維酵母在制備含有類似哺乳動物細(xì)胞n-聚糖修飾的糖蛋白中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體一種利用馬克斯克魯維酵母制備含類似哺乳動物細(xì)胞N?聚糖修飾結(jié)構(gòu)的糖蛋白的方法。本發(fā)明以馬克斯克魯維酵母FIM1作為出發(fā)菌株，利用基因組編輯技術(shù)刪除馬克斯克魯維酵母FIM1基因組上的基因URA3后作為宿主菌株，重組表達(dá)N?聚糖糖蛋白；并進(jìn)一步在基因MNN1的上游5’?UTR上插入AT序列，以弱化MNN1的表達(dá)，提高類似哺乳動物細(xì)胞N?聚糖糖鏈結(jié)構(gòu)的合成。所制備的糖蛋白的N?聚糖的糖鏈具有類似哺乳動物細(xì)胞N?聚糖的糖鏈結(jié)構(gòu)，存在雜合型、復(fù)合型的糖鏈，在糖鏈上可同時存在唾液酸、巖藻糖。本發(fā)明可以廣泛制備與哺乳動物細(xì)胞類似的N?聚糖的糖蛋白。

技術(shù)研發(fā)人員：呂紅,周峻崗,周詩昊,莫文娟
受保護(hù)的技術(shù)使用者：復(fù)旦大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15