本發(fā)明屬于植物基因工程，具體涉及梨pbrgis1基因功能及其在促進(jìn)梨花粉管生長中的應(yīng)用。本發(fā)明從‘碭山酥梨’花粉中克隆得到pbrgis1基因，通過反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染(odn)和花粉磁轉(zhuǎn)染過表達(dá)表明，pbrgis1促進(jìn)花粉管頂端活性氧(ros)水平和減少纖維素含量的變化，進(jìn)而促進(jìn)梨花粉管的生長。

背景技術(shù)：

1、自交不親和(si)是一種生殖策略，可以防止自交受精并促進(jìn)雜交，從而增強(qiáng)物種多樣性。在薔薇科中，包括梨和蘋果在內(nèi)的果樹表現(xiàn)出配子體自交不親和性(gsi)，這是由包含雌性決定因子(s-rnase)和雄性決定因子(slf/sfbs)的s基因座基因控制的(franklinet?al.2008；kao?et?al.2004；chen?et?al.2018；ushijimaket?al.2003)。當(dāng)來自同一s位點(diǎn)的花粉落在柱頭上時(shí)，s-rnase會引起毒性并破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞壁組分和活性氧(ros)水平，導(dǎo)致受精失敗(wang?et?al.2010；chen?et?al.2018；wu?et?al.2023a)。相反，來自不同s位點(diǎn)的花粉可以受精，因?yàn)閟kp1-culin1-f-box(scf)復(fù)合物中的slf/sfbs基因可以中和s-rnase，促進(jìn)花粉管的伸長(hua?et?al.2006)。目前，還發(fā)現(xiàn)了許多與si反應(yīng)相關(guān)的外部因素，包括富含亮氨酸的重復(fù)延長序列(lrx；wu?et?al.2023a)，gpi錨定蛋白(cobra；wu?et?al.2023b)，肌醇加氧酶(miox3；xu?et?al.2024)，果膠甲酯酶(pme44；tanget?al.2023)，自交不親和花粉蛋白(sipp；garciavalencia?et?al.2017)，可溶性無機(jī)焦磷酸酶(ppa；li?et?al.2018)。

2、梨作為世界型的水果，成功授粉受精是保證梨產(chǎn)量的關(guān)鍵。本研究獲得了梨花粉中的新基因pbrgis1，并且研究其對梨花粉管生長的影響和在梨自交不親和過程中所起到的作用。探索花粉磁轉(zhuǎn)染技術(shù)并將其應(yīng)用到實(shí)際中，可以很大程度上降低人工授粉成本，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也具有相當(dāng)重要的理論和實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供梨pbrgis1基因或與所述pbragp16基因相關(guān)的生物材料在促進(jìn)梨花粉管生長中的應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明請求保護(hù)pbrgis1基因或與所述pbrgis1基因相關(guān)的生物材料在如下(a1)-(a6)中的至少一種應(yīng)用：

4、(a1)在促進(jìn)梨花粉管生長中的應(yīng)用；

5、(a2)在制備促進(jìn)梨花粉管生長產(chǎn)品中的應(yīng)用；

6、(a3)在提高梨花粉管頂端ros水平中的應(yīng)用；

7、(a4)在制備提高梨花粉管頂端ros水平產(chǎn)品中的應(yīng)用；

8、(a5)在減少梨花粉管頂端纖維素含量中的應(yīng)用；

9、(a6)在制備減少梨花粉管頂端纖維素含量產(chǎn)品中的應(yīng)用；

10、(a7)在提高梨體外授粉效率中的應(yīng)用；

11、(a8)在制備提高梨體外授粉效率產(chǎn)品中的應(yīng)用；

12、所述的pbrgis1基因?yàn)槿缦?b1)-(b3)中的任意一種dna分子：

13、(b1)編碼區(qū)包括如seq?id?no.1所示核苷酸序列的dna分子；

14、(b2)核苷酸序列如seq?id?no.1所示的dna分子；

15、(b3)在嚴(yán)格條件下與(b1)或(b2)限定的dna序列雜交且編碼與促進(jìn)梨花粉管生長相關(guān)蛋白的dna分子。

16、進(jìn)一步，上述的應(yīng)用中，所述的與pbrgis1基因相關(guān)的生物材料為如下(c1)-(c6)中的至少一種：

17、(c1)所述pbrgis1基因編碼的蛋白；

18、(c2)含有所述pbrgis1基因的表達(dá)盒；

19、(c3)含有所述pbrgis1基因的重組載體、或含有(c2)所述表達(dá)盒的重組載體；

20、(c4)含有所述pbrgis1基因的重組微生物、或含有(c2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有(c3)所述重組載體的重組微生物；

21、(c5)含有所述pbrgis1基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有(c2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有(c3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；

22、(c6)含有所述pbrgis1基因的磁轉(zhuǎn)染試劑、或含有(c2)所述表達(dá)盒的磁轉(zhuǎn)染試劑、或含有(c3)所述重組載體的磁轉(zhuǎn)染試劑。

23、更進(jìn)一步，所述pbrgis1基因編碼的蛋白是如下(d1)或(d2)或(d3)：

24、(d1)氨基酸序列如seq?id?no.2所示的蛋白質(zhì)；

25、(d2)將seq?id?no.2所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與促進(jìn)梨花粉管生長相關(guān)的由seq?id?no.2衍生的蛋白質(zhì)；

26、(d3)將(d1)或(d2)的n末端或/和c末端連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)。

27、進(jìn)一步，上述的應(yīng)用為將所述的pbrgis1基因在梨花粉管中穩(wěn)定過表達(dá)，促進(jìn)梨花粉管生長或/和提高梨花粉管頂端ros水平或/和降低纖維素含量。更進(jìn)一步，利用磁轉(zhuǎn)染過表達(dá)技術(shù)體外處理梨花粉將所述的pbrgis1基因在梨花粉管中穩(wěn)定過表達(dá)。

28、第二方面，本發(fā)明請求保護(hù)一種促進(jìn)梨花粉管生長的方法，將前述的pbrgis1基因在梨花粉管中穩(wěn)定過表達(dá)，促進(jìn)梨花粉管生長。

29、第三方面，本發(fā)明請求保護(hù)一種提高梨花粉管頂端ros水平或/和減少纖維素含量的方法，將前述的pbrgis1基因在梨花粉管中穩(wěn)定過表達(dá)，提高梨花粉管頂端ros水平或/和減少纖維素含量。

30、進(jìn)一步，上述的方法中，利用磁轉(zhuǎn)染過表達(dá)技術(shù)體外處理梨花粉將所述的pbrgis1基因在梨花粉管中穩(wěn)定過表達(dá)。

31、更進(jìn)一步，所述磁轉(zhuǎn)染過表達(dá)技術(shù)具體包括以下步驟：

32、(1)設(shè)計(jì)引物pcr擴(kuò)增pbrgis1基因，將所述的pbrgis1基因插入到lat52::gfp載體的xbai和bamhi的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pbrgis1-lat52::gfp；

33、(2)將轉(zhuǎn)染試劑和所述的重組質(zhì)粒pbrgis1-lat52::gfp混合制備/pbrgis1-lat52::gfp轉(zhuǎn)染試劑，采用所述的

34、/pbrgis1-lat52::gfp轉(zhuǎn)染試劑處理花粉細(xì)胞。

35、本發(fā)明從‘碭山酥梨’花粉中篩選鑒定、克隆得到的功能基因pbrgis1并將其在促進(jìn)梨花粉管生長中進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明利用植物基因克隆技術(shù)從‘碭山酥梨’花粉中克隆得到基因pbrgis1。通過odn和花粉磁轉(zhuǎn)染試驗(yàn)體外處理‘碭山酥梨’花粉，結(jié)果顯示，過表達(dá)pbrgis1基因能積極地促進(jìn)花粉管生長，同時(shí)pbrgis1基因表達(dá)的變化與花粉管頂端ros水平和纖維素含量的變化有關(guān)。此外，pbrgis1也參與自交不親和反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。本發(fā)明采用花粉磁轉(zhuǎn)染技術(shù)研究花粉管中基因的功能，為提高授粉效率方面提供了廣闊的應(yīng)用前景。

36、本發(fā)明所述的室溫一般為25±10℃，但不限于此。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有優(yōu)點(diǎn)和效果：

38、(1)pbrgis1基因的發(fā)現(xiàn)，為提高梨體外授粉效率提供了新的思路，降低勞動成本，為實(shí)施綠色農(nóng)業(yè)提供新途徑。

39、(2)與傳統(tǒng)的花粉基因槍技術(shù)相比，通過花粉磁轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)花粉管基因的方法，具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡便、節(jié)約成本、可定向改良性狀等優(yōu)點(diǎn)。