本發(fā)明屬于工業(yè)生物，具體涉及一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、海藻糖（trehalose）是由兩個(gè)葡萄糖分子通過(guò)α,α-1-1糖苷鍵結(jié)合而成的非還原性雙糖，具有很多優(yōu)異的化學(xué)性質(zhì)和獨(dú)特的生物活性，尤其在一些極端環(huán)境中，海藻糖能夠在生物細(xì)胞表面形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)生物分子結(jié)構(gòu)不被破壞，從而維持生命體的生命過(guò)程和生物特征。因其獨(dú)特的性能，在醫(yī)療、食品、藥品、生化、分子生物學(xué)領(lǐng)域起著至關(guān)重要的作用，有著“生命之糖”的美稱。目前，海藻糖的生產(chǎn)方法主要有生物法抽提、酶法合成、微生物法發(fā)酵以及基因工程法，工業(yè)生產(chǎn)多采用酶法合成，但酶法合成使用的原料淀粉會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此，需要一種低成本的海藻糖生產(chǎn)方法。

2、嗜甲烷菌（ methanotroph）是天然的甲烷利用菌株，能夠以甲烷為唯一的碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝。嗜甲烷菌利用其天然甲烷轉(zhuǎn)化途徑，可以在溫和條件下實(shí)現(xiàn)甲烷的生物利用，因而具有較好的發(fā)展?jié)摿Α４送?，隨著沼氣生產(chǎn)技術(shù)和頁(yè)巖氣開(kāi)采技術(shù)的不斷提升、糖類(lèi)底物成本上漲以及全球糧食問(wèn)題日益加重，生物制造過(guò)程迫切需要開(kāi)發(fā)廉價(jià)的、非食品的新一代碳原料。但是目前還未見(jiàn)利用嗜甲烷菌生產(chǎn)海藻糖的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，解決現(xiàn)有的用酶法合成海藻糖生產(chǎn)成本高的問(wèn)題。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面，公開(kāi)了一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌，通過(guò)在宿主菌中過(guò)表達(dá)麥芽寡糖基海藻糖水解酶，同時(shí)引入能夠合成海藻糖的麥芽寡糖基海藻糖合酶得到；

4、其中，所述宿主菌為嗜甲烷菌。

5、優(yōu)選地，宿主菌為嗜甲烷菌 methylotuvimicrobium?buryatense5gb1 、 alkalicoccus?glycogeneswonf2802或 methylotuvimicrobium?sanxanigenensng09；

6、其中， alkalicoccus?glycogeneswonf2802已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為cgmcc?no.28614； methylotuvimicrobium? sanxanigenensng09已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)為cgmcc?no.30951。

7、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述麥芽寡糖基海藻糖水解酶來(lái)源于嗜甲烷菌 methylotuvimicrobium?buryatense5gb1、 alkalicoccus?glycogeneswonf2802或 methylotuvimicrobium?sanxanigenensng09。

8、優(yōu)選地，麥芽寡糖基海藻糖水解酶的編碼基因 trez的序列如seq?id?no.1所示。

9、優(yōu)選地，所述麥芽寡糖基海藻糖合酶來(lái)源于 methylotuvimicrobium? alcaliphilum20z菌株。

10、進(jìn)一步優(yōu)選地，麥芽寡糖基海藻糖合酶的編碼基因 trey的序列如seq?id?no.2所示。

11、本發(fā)明的第二個(gè)方面，公開(kāi)了上述產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

12、1）將麥芽寡糖基海藻糖水解酶的編碼基因 trez按照ptac- trez的順序串聯(lián)，得到ptac-hug片段；利用基因編輯手段，將宿主菌上的 equ24_20670基因用ptac-hug片段替換，得到嗜甲烷工程菌菌株tre1；

13、2）將麥芽寡糖基海藻糖合酶的編碼基因 trey與質(zhì)粒pawp89相連，構(gòu)建重組質(zhì)粒pawp89- trey；

14、3）將步驟2）得到的重組質(zhì)粒pawp89- trey轉(zhuǎn)入步驟1）得到的嗜甲烷工程菌菌株tre1中，得到產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌。

15、本發(fā)明的第三個(gè)方面，公開(kāi)了一種生產(chǎn)海藻糖的方法，包括如下步驟：

16、1）將上述產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌的種子液接種于nms液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)初始及過(guò)程中向培養(yǎng)體系內(nèi)補(bǔ)充富含甲烷的氣體，30℃發(fā)酵，得到發(fā)酵液；

17、其中，富含甲烷的氣體中，甲烷的添加量為培養(yǎng)體系的氣相體積的20%；

18、2）收集步驟1）得到的發(fā)酵液的菌體，加水混勻，沸水浴4?h，過(guò)濾、蒸發(fā)濃縮，乙醇醇沉，離心，去上清液，洗滌，再次離心，沉淀為海藻糖。

19、本發(fā)明的第四個(gè)方面，公開(kāi)了上述產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌在生產(chǎn)海藻糖中的應(yīng)用，產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌利用富含甲烷的氣體生產(chǎn)海藻糖。

20、優(yōu)選地，所述的富含甲烷的氣體為沼氣、頁(yè)巖氣、天然氣或油田氣。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

22、本發(fā)明提供的一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌，利用嗜甲烷菌中存在麥芽寡糖基海藻糖水解酶mth的特性，以嗜甲烷菌作為宿主菌，通過(guò)在宿主菌中過(guò)表達(dá)內(nèi)源基因mth，強(qiáng)化了海藻糖的內(nèi)源合成路徑，提高了以甲烷為碳源合成海藻糖的產(chǎn)量和效率。通過(guò)代謝工程改造，通過(guò)導(dǎo)入異源基因麥芽寡糖基海藻糖合酶mts，重構(gòu)了麥芽寡糖基海藻糖的異源合成路徑，提高了以甲烷為碳源合成海藻糖的產(chǎn)量和效率。該產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌以清潔的一碳能源結(jié)合微生物發(fā)酵法和基因技術(shù)，合成海藻糖的產(chǎn)量能夠達(dá)到克級(jí)以上，能夠應(yīng)用在海藻糖的生產(chǎn)中，為利用一碳原料甲烷生產(chǎn)海藻糖提供新的路徑，實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排的同時(shí)實(shí)現(xiàn)海藻糖的高效、低碳生物合成。

技術(shù)特征：

1.一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌，其特征在于，通過(guò)在宿主菌中過(guò)表達(dá)麥芽寡糖基海藻糖水解酶，同時(shí)引入能夠合成海藻糖的麥芽寡糖基海藻糖合酶得到；

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷工程菌，其特征在于，宿主菌為嗜甲烷菌methylotuvimicrobium?buryatense?5gb1、alkalicoccus?glycogenes?wonf2802或methylotuvimicrobium?sanxanigenens?ng09；

3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌，其特征在于，所述麥芽寡糖基海藻糖水解酶來(lái)源于嗜甲烷菌methylotuvimicrobium?buryatense?5gb1、alkalicoccus?glycogenes?wonf2802或methylotuvimicrobium?sanxanigenens?ng09。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌，其特征在于，麥芽寡糖基海藻糖水解酶的編碼基因trez的序列如seq?id?no.1所示。

5.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌，其特征在于，所述麥芽寡糖基海藻糖合酶來(lái)源于methylotuvimicrobium?alcaliphilum?20z菌株。

6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌，其特征在于，麥芽寡糖基海藻糖合酶的編碼基因trey的序列如seq?id?no.2所示。

7.權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

8.一種生產(chǎn)海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌在生產(chǎn)海藻糖中的應(yīng)用，其特征在于，產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌利用富含甲烷的氣體生產(chǎn)海藻糖。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的富含甲烷的氣體為沼氣、頁(yè)巖氣、天然氣或油田氣。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。以嗜甲烷菌Methylotuvimicrobium?buryatense?5GB1、Alkalicoccus?glycogenes?WONF2802或Methylotuvimicrobium?sanxanigenens?NG09為宿主菌，通過(guò)在宿主菌中導(dǎo)入麥芽寡糖基海藻糖合酶MTS，過(guò)表達(dá)麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTH，得到產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌。該產(chǎn)海藻糖的嗜甲烷基因工程菌在以甲烷或甲醇為碳源的條件下，生產(chǎn)得到的海藻糖產(chǎn)量能夠達(dá)到克級(jí)以上，能夠?yàn)楹Ｔ逄堑纳虡I(yè)化生產(chǎn)提供一種低碳生物合成新途徑，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：費(fèi)強(qiáng),梅佳佳,范代娣,傅容湛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西安交通大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15