本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種磁性固定化酶及其制備方法和在制備殼寡糖中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、殼寡糖是天然糖中的唯一大量存在的帶正電荷的堿性氨基多糖，它同時(shí)具有游離的氨基和羥基，因而具有顯著的生物活性和功能。廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、化妝品等眾多行業(yè)。它具有殼聚糖所沒有的較高溶解度，全溶于水，容易被生物體吸收利用等諸多獨(dú)特的功能，其作用為殼聚糖的14倍。

2、殼寡糖的制備一般有三種方法：化學(xué)法，物理法，酶解法。利用酸對(duì)殼聚糖進(jìn)行降解是一種最基本和簡(jiǎn)單的方法，氧化降解法是近年來國(guó)內(nèi)外研究比較多的殼聚糖降解方法，其中h2o2氧化降解法因成本低、降解速度相對(duì)較快、產(chǎn)品相對(duì)分子質(zhì)量低且分布窄、無殘毒、易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化而倍受關(guān)注。物理降解法速度快、無副產(chǎn)物、無環(huán)境污染，是較理想的高聚物降解方法。酶降解法與其它降解方法相比，具有無副反應(yīng)、降解條件溫和、降解過程及降解產(chǎn)物相對(duì)分子量分布容易控制、制備的低聚殼聚糖生物活性高，產(chǎn)物不用除鹽等優(yōu)勢(shì)，近年來國(guó)內(nèi)外常有相關(guān)的報(bào)道。

3、根據(jù)使用的酶不同，酶解法又分為專一性酶降解（如殼聚糖酶、溶菌酶）和非專一性酶降解（如脂肪酶、蛋白酶和纖維素酶等）。但是在酶法降解中由于游離酶回收難度極高，會(huì)造成一定程度上的酶浪費(fèi)。因此，亟需尋找一種易于回收酶，重復(fù)使用酶的方式且產(chǎn)物得率高的生產(chǎn)殼寡糖的方法。

4、相關(guān)研究報(bào)道了生物法生產(chǎn)殼寡糖的方法，如專利文獻(xiàn)cn1772915a公開了一種利用固定化酶生產(chǎn)殼寡糖的方法，以殼聚糖為底物，將酶固定在介質(zhì)表面，提供了一種利用固定化酶降解殼聚糖生產(chǎn)殼寡糖的方法。

5、然而，由于酶固定在介質(zhì)表面，在反應(yīng)中易受到損害，雖然固定化酶的回收相比游離酶而言較為容易，但由于酶在介質(zhì)表面直接暴露，重復(fù)利用時(shí)活性衰減較快。而埋藏結(jié)構(gòu)的固定化酶又因不能有效接觸底物而導(dǎo)致反應(yīng)整體效率低下。

6、目前利用固定化酶技術(shù)生產(chǎn)殼寡糖的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但是操作過程還需進(jìn)一步優(yōu)化，酶轉(zhuǎn)化率有待進(jìn)一步提升，以更好的應(yīng)用于殼寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明利用雙孔二氧化硅與氨基修飾的四氧化三鐵制備成酶的固定化載體，獲得磁性固定化酶（fe3o4@sio2固定化酶），將該固定化酶應(yīng)用于以殼聚糖為底物的殼寡糖的制備中，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)酶的方便回收，且酶反應(yīng)效率高、成本低。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

3、一種磁性固定化酶，包括載體與所述載體負(fù)載的酶，所述載體為磁性納米顆粒修飾的雙孔二氧化硅納米顆粒，所述雙孔二氧化硅納米顆粒同時(shí)含有若干大孔和若干小孔，所述大孔的孔徑為20~40nm，所述小孔的孔徑為2~5nm。

4、優(yōu)選的，所述酶為幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶、纖維素酶、溶菌酶或脂肪酶中的一種或多種。

5、優(yōu)選的，所述磁性納米顆粒為fe3o4納米顆粒。

6、優(yōu)選的，所述磁性納米顆粒與所述雙孔二氧化硅納米顆粒通過表面的酰胺鍵連接。

7、優(yōu)選的，所述酰胺鍵由磁性納米顆粒表面修飾的氨基與所述雙孔二氧化硅納米顆粒表面的羥基形成。

8、優(yōu)選的，所述氨基修飾的磁性納米顆粒由氨基硅烷偶聯(lián)劑與磁性納米顆粒反應(yīng)得到。

9、優(yōu)選的，所述氨基硅烷偶聯(lián)劑為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷。

10、優(yōu)選的，所述雙孔二氧化硅由如下方法制得：

11、將十六烷基三甲基溴化銨、氫氧化鈉在水中混合，0.5~1h后加入硅源，攪拌反應(yīng)后，固液分離，固體干燥過夜后，保溫4~5h，即得。

12、優(yōu)選的，所述十六烷基三甲基溴化銨與硅源的質(zhì)量比為(0.2~0.65):1。

13、優(yōu)選的，所述硅源為正硅酸乙酯。

14、優(yōu)選的，所述的保溫的溫度為550~560?℃。

15、本發(fā)明還提供所述磁性固定化酶的制備方法，包括如下步驟：

16、將所述載體加入所述酶的溶液中，搖床混合4~6h即得。

17、優(yōu)選的，所述制備方法還包括搖床混合后采用緩沖溶液沖洗的步驟。優(yōu)選的，所述緩沖溶液為乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。

18、優(yōu)選的，所述酶的溶液的濃度為0.5~3?g/l。

19、本發(fā)明還提供所述磁性固定化酶在制備殼寡糖中的應(yīng)用。

20、優(yōu)選的，所述應(yīng)用以殼聚糖為底物，以乙酸-乙酸鈉緩沖溶液為溶劑采用所述磁性固定化酶反應(yīng)，得到殼寡糖。

21、優(yōu)選的，所述應(yīng)用中，反應(yīng)體系為：ph?4.8~5.5，溫度50~55?℃，所述磁性固定化酶與底物的質(zhì)量比為100~300?mg/g。

22、本發(fā)明具有如下有益效果：

23、本發(fā)明利用磁性雙孔二氧化硅固定酶，使載體具有強(qiáng)烈磁性，回收起來更為快速方便，實(shí)現(xiàn)較高轉(zhuǎn)化率，具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)與顯著創(chuàng)新。

24、本發(fā)明所述的載體，具有強(qiáng)烈磁性使得回收非常容易，大大降低了酶促反應(yīng)的成本，降低了后續(xù)分離成本。

25、此外，雙孔二氧化硅使得酶固定于孔內(nèi)或半固定于孔內(nèi)，避免了酶蛋白直接溶于反應(yīng)液中帶來的后續(xù)分離問題，同時(shí)減少了酶在反應(yīng)中的受損，重復(fù)利用中酶活的衰減顯著減小，進(jìn)一步降低了酶的使用成本。

26、本發(fā)明的固定化酶生產(chǎn)殼寡糖能夠縮短反應(yīng)周期、減少反應(yīng)成本，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，且適合于工業(yè)上廣泛應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.一種磁性固定化酶，其特征在于，包括載體與所述載體負(fù)載的酶，所述載體為磁性納米顆粒修飾的雙孔二氧化硅納米顆粒，所述雙孔二氧化硅納米顆粒同時(shí)含有若干大孔和若干小孔，所述大孔的孔徑為20~40nm，所述小孔的孔徑為2~5nm，優(yōu)選的，所述磁性納米顆粒為fe3o4納米顆粒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化酶，其特征在于，所述酶為幾丁質(zhì)酶、殼聚糖酶、纖維素酶、溶菌酶或脂肪酶中的一種或多種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化酶，其特征在于，所述磁性納米顆粒與所述雙孔二氧化硅納米顆粒通過表面的酰胺鍵連接。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的磁性固定化酶，其特征在于，所述酰胺鍵由磁性納米顆粒表面修飾的氨基與所述雙孔二氧化硅納米顆粒表面的羥基形成，所述氨基修飾的磁性納米顆粒由氨基硅烷偶聯(lián)劑與磁性納米顆粒反應(yīng)得到；優(yōu)選的，所述氨基硅烷偶聯(lián)劑為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性固定化酶，其特征在于，所述雙孔二氧化硅由如下方法制得：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磁性固定化酶，其特征在于，所述十六烷基三甲基溴化銨與硅源的質(zhì)量比為(0.2~0.65):1。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的磁性固定化酶，其特征在于，所述硅源為正硅酸乙酯。

8.權(quán)利要求1-7任一所述磁性固定化酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.權(quán)利要求1-7任一所述磁性固定化酶在制備殼寡糖中的應(yīng)用，其特征在于，包括：

10.?根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述反應(yīng)的體系為：ph?4.8~5.5，溫度50~55?℃，所述磁性固定化酶與底物的質(zhì)量比為100~300?mg/g。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種磁性固定化酶及其制備方法和在制備殼寡糖中的應(yīng)用，該固定化酶包括載體與所述載體負(fù)載的酶，所述載體為磁性納米顆粒修飾的雙孔二氧化硅納米顆粒，所述雙孔二氧化硅納米顆粒同時(shí)含有若干大孔和若干小孔，所述大孔的孔徑為20~40nm，所述小孔的孔徑為2~5nm，該磁性固定化酶具有強(qiáng)烈磁性，回收起來更為快速方便，重復(fù)使用性能良好，操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用前景廣闊，適合在工業(yè)上制備殼寡糖。

技術(shù)研發(fā)人員：朱麗英,郭瑞,閆昭旭,江凌
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15