本發(fā)明屬于多重qpcr，具體涉及一種用于牛筋草耐藥基因突變檢測的多重qpcr引物探針組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、牛筋草(eleusine?indica(l.)gaertn.)是一種禾本科穇屬雜草，根系發(fā)達(dá)，耐旱、耐高溫、繁殖能力強(qiáng)，且極易對除草劑產(chǎn)生抗藥性，是一種全球性的惡性雜草。牛筋草在我國南北地區(qū)均有分布，在南方地區(qū)發(fā)生、為害尤其嚴(yán)重，主要侵害玉米、大豆、花生、棉花等糧食作物及果園等。近年來，隨著南方稻-菜/稻油等輪作模式的推廣，牛筋草逐漸進(jìn)入稻田，成為稻田難防雜草之一。

2、草甘膦、草銨膦是防控牛筋草的主要除草劑，長期、高頻、單一的使用，導(dǎo)致牛筋草種群對這兩種除草劑逐漸進(jìn)化出抗性，并隨著風(fēng)力、水流和跨區(qū)作業(yè)農(nóng)機(jī)等傳播、蔓延。雜草對除草劑的抗藥性機(jī)理主要分為靶標(biāo)抗性和非靶標(biāo)抗性兩種。靶標(biāo)抗性是指除草劑靶標(biāo)基因位點(diǎn)突變、復(fù)增或過表達(dá)等，導(dǎo)致雜草對除草劑的敏感性下降；非靶標(biāo)抗性一般是指由除草劑在雜草中被吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝，或雜草抗氧化能力增強(qiáng)所致的抗性機(jī)理。目前文獻(xiàn)報(bào)道顯示，牛筋草對草甘膦和草銨膦的抗藥性主要是靶標(biāo)抗性機(jī)理，包括草甘膦靶基因epsps復(fù)增和其編碼蛋白的第102、106位氨基酸的突變；草銨膦靶基因gs編碼蛋白的第59位氨基酸的突變(jingchao?chen等)。近年來，隨著除草劑的大量使用，雜草對除草劑的抗藥性已從單一抗性向多抗性發(fā)展。我們前期研究檢測結(jié)果顯示，南方農(nóng)作區(qū)大部分牛筋草種群已對草甘膦、草銨膦等多種除草劑產(chǎn)生抗藥性。牛筋草抗性機(jī)理快速檢測在了解雜草抗種群發(fā)生狀態(tài)、預(yù)估雜草抗性水平，指導(dǎo)田間除草劑科學(xué)選擇和使用、促進(jìn)除草劑減施增效和保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面都具有重要意義。

3、常規(guī)抗性雜草的鑒定主要通過室內(nèi)盆栽生測法測定，方法包括田間采樣、種子收集、室內(nèi)培育、莖葉噴霧、生物測定等步驟，周期為2個(gè)月左右，費(fèi)時(shí)費(fèi)工；而在分子檢測技術(shù)方面則主要通過pcr結(jié)合sanger測序、熒光定量pcr(qpcr)、dcaps等檢測靶基因的突變、復(fù)增和表達(dá)情況，檢測周期在7天以上，專業(yè)技術(shù)背景要求高、檢測靶點(diǎn)數(shù)少，檢測靈敏度低，數(shù)據(jù)解讀繁瑣等，最重要的是這些分子檢測技術(shù)一次僅能檢測其中一種抗藥性分子機(jī)制，不能滿足多抗性雜草多種分子機(jī)制的快速檢測需求。

4、本發(fā)明旨在開發(fā)一種基于實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)的檢測技術(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對牛筋草抗藥性機(jī)理的快速、簡單、準(zhǔn)確、多靶點(diǎn)的檢測方案。該方案一方面可以降低對專業(yè)技術(shù)人員和設(shè)備的依賴，使得更多的基層人員和機(jī)構(gòu)能夠進(jìn)行檢測，有助于擴(kuò)大檢測范圍，提高檢測效率，另一方面，快速檢測技術(shù)可以顯著縮短這些步驟的時(shí)間，使檢測結(jié)果更加迅速，這對于及時(shí)采取防治措施、防止耐藥牛筋草的擴(kuò)散具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于牛筋草耐藥基因突變檢測的多重qpcr引物探針組及試劑盒。

2、本發(fā)明的目的還在于提供上述引物探針組以及試劑盒在牛筋草耐藥基因突變檢測中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的上述第一個(gè)目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種用于牛筋草耐藥基因突變檢測的多重qpcr引物探針組，所述的引物探針組如下所示：

4、

5、其中：als為內(nèi)參基因，gs1、epsps為牛筋草耐藥基因，gs1存在gs1-1?r59突變，epsps存在t102i/p106a/p106s突變。

6、gs1-1-gf2是基于amrs?pcr技術(shù)篩選獲得，gs1-1-gb2用于封閉gs1-1野生型位點(diǎn)。epsp-p2為epsps通用探針，用于cnv檢測。102i-t用于檢測epsps?t102i突變，102-b用于封閉野生型102位點(diǎn)，106-p用于檢測epsps?p106a及p106s突變，106-b用于封閉106p。

7、本發(fā)明還提供了用于牛筋草耐藥基因突變檢測的試劑盒，包括核酸擴(kuò)增試劑，所述核酸擴(kuò)增試劑包括所述的引物探針組。

8、優(yōu)選地，所述的核酸擴(kuò)增試劑中，各組分的濃度和用量如下：

9、 組分 反應(yīng)終濃度，nm 配置10x?assay?100μl各組分所需體積，母液濃度為100μm als-f 300 3μl als-r 300 3μl als-p 100 1μl gs1-1-gf2 200 2μl gs1-1-gb2 200 2μl gs1-1-r 200 2μl gs1-1-p 150 1.5μl epsp-f 300 3μl epsp-r 300 3μl epsp-p2 300 3μl 102i-t 400 4μl 102-b 300 3μl 106-p 300 3μl 106-b 300 3μl <![cdata[h₂o]]> 63.5μl

10、優(yōu)選地，采用所述的核酸擴(kuò)增試劑進(jìn)行qpcr擴(kuò)增時(shí)，采用的擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

11、

12、進(jìn)一步地，還包括野生型對照、陽性對照和無模板對照，所述陽性對照使用包含gs1-1?r59突變及epsps基因t102i/p106a/p106s突變的牛筋草植株基因組核酸，無模板對照使用無酶水。

13、本發(fā)明的上述第二個(gè)目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：所述的引物探針組或所述的試劑盒在牛筋草耐藥基因突變檢測中的應(yīng)用。

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

15、1.高通量：在雜草抗藥性檢測方面，現(xiàn)有的pcr、熒光定量pcr(qpcr)、dcaps等分子檢測技術(shù)一次僅能檢測單一基因的一類突變情況，而本技術(shù)適用于同時(shí)檢測多個(gè)基因多種突變，包括靶基因多位點(diǎn)突變及復(fù)增等，適合草甘膦和草銨膦抗性牛筋草種群的大規(guī)模篩查；

16、2.操作簡便：現(xiàn)有的分子檢測技術(shù)檢測多種抗性機(jī)制時(shí)需要多個(gè)反應(yīng)管，本技術(shù)可以在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)目標(biāo)的擴(kuò)增，減少了樣本和試劑的消耗，操作更簡便；

17、3.結(jié)果直觀：現(xiàn)有的分子檢測技術(shù)須通過測序比對或凝膠電泳或數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等相對繁瑣的分析過程，本技術(shù)反應(yīng)結(jié)束后即可通過不同熒光標(biāo)記直觀看到檢測結(jié)果，一目了然；

18、4.更省時(shí)：傳統(tǒng)室內(nèi)生測技術(shù)鑒定雜草抗藥性需3個(gè)月左右；現(xiàn)有的分子檢測技術(shù)耗時(shí)也在3-7天甚至1月不等，本技術(shù)可在1天內(nèi)得到多個(gè)直觀的目標(biāo)檢測結(jié)果。