本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，尤其涉及硝基還原酶熒光探針的制備方法及檢測腫瘤內(nèi)環(huán)境中過表達的ntr(硝基還原酶)的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、缺氧是腫瘤微環(huán)境重要的特征之一。低氧微環(huán)境與放化療的耐藥性相關(guān)，可能導(dǎo)致預(yù)后不良和腫瘤復(fù)發(fā)的可能性。因此，研究缺氧程度對評估腫瘤進展和預(yù)測治療反應(yīng)具有重要的臨床意義。在缺氧的癌細胞中，硝基還原酶（ntr，一種黃素蛋白酶）會過度表達。作為一種還原酶，ntr能在作為氫供體的?nadh/nadph?存在下將含硝基的芳香衍生物還原成相應(yīng)的羥胺或氨基衍生物。此外，ntr水平的上調(diào)已被確定為缺氧的標志和腫瘤標志物。因此，迫切需要監(jiān)測缺氧腫瘤中ntr的表達。

2、熒光探針因其易用性、高靈敏度和無與倫比的時空分辨率而受到廣泛關(guān)注。迄今為止，已報道了許多用于檢測ntr和腫瘤缺氧水平的"非對稱"熒光探針。遺憾的是，大多數(shù)探針在紫外和可見光譜范圍（650納米以下）發(fā)光，受到背景自發(fā)熒光的強烈干擾，組織穿透深度低。對于?ntr?的定量檢測，近紅外熒光探針更具優(yōu)勢，因為它們具有穿透深度更深、對生物樣本損傷更小的優(yōu)點。因此，開發(fā)一種能在近紅外熒光發(fā)射窗口精確測量ntr的靈敏探針仍是一項重大挑戰(zhàn)。

3、基于以上考慮，我們開發(fā)了一種基于雙花菁基團的新型近紅外分子熒光探針。強吸電子基團亞硝基的存在可以實現(xiàn)熒光淬滅，有效降低背景信號。同時，熒光團固有的近紅外發(fā)射具有深層組織穿透能力，可避免自發(fā)光，最大限度地減少背景干擾。該探針可在nadh存在下被ntr激活，并發(fā)出明顯的近紅外熒光。在缺氧條件下，通過熒光成像可觀察到mda-mb-231細胞以及mcf-7細胞。本發(fā)明為研究ntr活性和缺氧相關(guān)生物過程提供了一種實用工具。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：

2、提供一個對硝基還原酶響應(yīng)的新化合物，以開發(fā)一種新的小分子熒光探針。

3、提供上述小分子熒光探針的制備方法。

4、提供該探針檢測腫瘤內(nèi)環(huán)境中ntr濃度的初步應(yīng)用。

5、技術(shù)方案：ntr小分子熒光探針的合成與表征：

6、化合物1的合成:

7、稱取1,8-萘內(nèi)酰亞胺(1.52?g,9.0?mmol),氫氧化鉀(1.68?g,30.0?mmol),碘乙烷(4.17g,26.7?mmol)加入無水n,n-二甲基甲酰胺中(40.0?ml)，混合物在90℃下攪拌反應(yīng)12小時。將反應(yīng)物冷卻至室溫后倒入100?ml冰水中,用乙酸乙酯(3×100?ml)提取粗產(chǎn)物。結(jié)合有機相,用水洗滌3次,隨后用無水硫酸鈉干燥。真空下除去溶劑,用石油醚：乙酸乙酯=20：1作為洗脫劑,柱層析得化合物1,黃色油狀物(1.41?g,79%).1h?nmr?(600?mhz,chloroform-d)? δ:?8.11?(dd,?j?=?8.1,?1.2?hz,?1h),?8.01?(dt,?j?=?8.0,?1.5?hz,1h),?7.91?(dt,?j?=?7.8,?1.6?hz,?1h),?7.69?(t,?j?=?8.0?hz,?1h),?7.40?(t,?j?=7.9?hz,?1h),?7.33?(dd,?j?=?8.1,?1.6?hz,?1h),?3.50?(q,?j?=?7.3?hz,?2h),?1.22(t,?j?=?7.3?hz,?3h).?13c?nmr?(125?mhz,?chloroform-d)? δ:?168.78,?134.15,131.47,?130.90,?130.78,?129.87,?128.60,?127.37,?126.76,?124.88,?51.16,?42.61,13.21.

8、化合物2的合成:

9、稱取化合物1(1.19?g,6.0?mmol)加入無水四氫呋喃?(20?ml)中，冰浴條件下加入甲基氯化鎂(3mol/l在四氫呋喃中,?3.0?ml,?9.0?mmol)。反應(yīng)混合物55℃攪拌小時后，冰浴條件下加入10?ml的2?mol/l鹽酸溶液進行酸化，并向上述溶液加入過量碘化鈉。過濾沉淀并用水和乙酸乙酯洗滌后進行干燥，得橙色固體產(chǎn)物?(965?mg,82%),?mp?109–110℃。1hnmr?(600?mhz,?chloroform-d)? δ:8.05?(dd,?j?=?7.5,?1.1?hz,?1h),?7.93?–?7.86?(m,2h),?7.70?–?7.58?(m,?3h),?4.86?(q,?j?=?7.5?hz,?2h),?3.12?(s,?2h),?1.56?(t,?j=?7.5?hz,?3h).;?13c?nmr?(151?mhz,?chloroform-d)? δ:?167.94,?142.23,?134.10,133.68,?132.65,?132.25,?129.18,?129.00,?126.42,?123.06,?116.35,?39.03,?14.38,13.19.

10、化合物3的合成:

11、稱取4-羥基間苯二甲醛(250?mg,1.65?mmol)和碳酸鉀（456?mg,3.3mmol）溶于10ml無水n,n-二甲基甲酰胺中(10.0?ml)中,隨后加入4-硝基芐基溴(427.5?mg,2.0?mmol),反應(yīng)混合物氮氣保護下室溫攪拌反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束后，混合物倒入100?ml冰水中，析出固體，抽濾得粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物溶于少量二氯甲烷中，加入100?ml正己烷,析出大量白色固體固體，抽濾得化合物3(329?mg,70%)。1h?nmr?(600?mhz,?dmso-d6)? δ:?10.49?(s,?1h),9.98?(s,?1h),?8.31?–?8.22?(m,?3h),?8.20?(dd,?j?=?8.7,?2.2?hz,?1h),?7.84?(d,?j=?8.8?hz,?2h),?7.52?(d,?j?=?8.7?hz,?1h),?5.60?(s,?2h).13c?nmr?(151?mhz,?dmso-d6)? δ:?194.22,?193.67,?163.07,?147.69,?141.35,?133.71,?131.97,?131.48,128.73,?125.72,?123.67,?116.43,?71.47.

12、化合物4的合成:

13、稱取化合物2(160?mg,0.5?mmol)和化合物3(57?mg,0.2?mmol)溶于甲苯/正丁醇(5.0?ml/5.0?ml),反應(yīng)混合物在氮氣保護下100℃攪拌12小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，得到的固體抽濾并用乙醚洗滌,得褐色固體(77?mg,60%)。1h?nmr?(600?mhz,?dmso-d6)? δ:9.54?(s,?1h),?9.12?(d,?j?=?5.9?hz,?1h),?8.90?–?8.83?(m,?2h),?8.67?(dd,?j?=19.6,?7.4?hz,?2h),?8.49?–?8.29?(m,?10h),?8.11?(dd,?j?=?13.9,?6.6?hz,?2h),8.02?(d,?j?=?8.4?hz,?2h),?7.97?–?7.91?(m,?2h),?7.52?(d,?j?=?8.5?hz,?1h),?5.66(s,?2h),?5.07?(d,?j?=?6.9?hz,?2h),?4.95?–?4.88?(m,?2h),?1.56?(t,?j?=?7.1?hz,3h),?1.42?(t,?j?=?7.1?hz,?3h).;?13c?nmr?(151?mhz,?dmso-d6),? δ:?170.80,?156.67,152.40,?150.80,?146.98,?146.90,?137.44,?128.60?(d,?j?=?6.6?hz),?128.28?(d,?j=?5.8?hz),?126.11,?122.53,?118.35,?118.23,?115.28,?115.16,?114.48,?113.67,76.01?(d,?j?=?4.0?hz),?42.74,?40.49,?38.60,?32.16,?27.91;?hrms?(esi):?calcdfor?c43h35n3o3,?[m]+,?m/z,?320.6334;?found,?320.6353.

14、附圖說明：

15、圖一為本發(fā)明的核磁共振氫譜示意圖

16、圖二為本發(fā)明的核磁共振碳譜示意圖

17、圖三為本發(fā)明的質(zhì)譜示意圖

18、圖四為本發(fā)明的反應(yīng)機理圖

19、圖五為本發(fā)明的紫外吸收光譜示意圖

20、圖六為本發(fā)明的不同ntr濃度梯度下熒光強度示意圖

21、圖七為本發(fā)明的選擇性與干擾性測試示意圖

22、圖八為本發(fā)明的ph干擾性測試示意圖

23、圖九為本發(fā)明的細胞毒性示意圖

24、圖十為本發(fā)明的共聚焦熒光成像示意圖

25、圖十一為本發(fā)明的共聚焦成像示意圖的熒光強度分析

26、化合物4的氫譜:?見附圖一

27、化合物4的碳譜：見附圖二

28、化合物4的質(zhì)譜：見附圖三

29、化合物4的反應(yīng)機理：見附

30、生物活性初步評價

31、紫外吸收光譜：?見附圖五

32、附圖說明：探針對ntr有明顯的響應(yīng)，說明該探針具有顯著的檢測ntr的能力。

33、不同濃度梯度下熒光強度的變化：?見附圖六

34、附圖說明：該熒光探針對ntr響應(yīng)靈敏，ntr濃度的輕微變化，導(dǎo)致其熒光強度的顯著變化。

35、選擇性干擾性測試：見附圖七

36、附圖說明：該熒光探針僅對ntr響應(yīng)，并且不受其他干擾物的影響。

37、ph干擾性測試：見附圖八

38、附圖說明：該探針（10?μm）不受ph變化的干擾，依舊能夠保留其在溶液中的穩(wěn)定性。

39、mtt實驗：見附圖九