本發(fā)明屬于酶工程以及乳制品加工，具體涉及米曲霉β-半乳糖苷酶突變體的高效表達(dá)及在乳品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乳糖不耐癥是體內(nèi)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)(ec3.2.1.23)分泌少而無(wú)法消化乳糖，可能會(huì)導(dǎo)致腹脹、惡心、腹部痙攣和腹瀉等癥狀。低/零乳糖飲食是解決乳糖不耐癥的重要辦法，β-半乳糖苷酶是工業(yè)上生產(chǎn)零乳糖食品用酶，廣泛應(yīng)用于乳品工業(yè)。目前市場(chǎng)上零乳糖乳品種類(lèi)單一，因此開(kāi)發(fā)新型零乳糖乳制品對(duì)于豐富市場(chǎng)和滿(mǎn)足國(guó)民健康需求具有重要意義。

2、β-半乳糖苷酶水解乳糖產(chǎn)生甜度更高的單糖，可以部分替代乳品中添加的蔗糖，具有生產(chǎn)低/無(wú)蔗糖乳品的潛力。研究表明牛奶(約含45g/l乳糖)中70％的乳糖水解后，其甜度的增加相當(dāng)于添加2％的蔗糖?，F(xiàn)有的無(wú)蔗糖乳制品口感較酸，并且額外添加了甜味劑。蘇本憲等(中國(guó)專(zhuān)利號(hào)：zl201910854000.0)通過(guò)添加赤蘚糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、甜菊糖苷或羅漢果甜苷制備無(wú)蔗糖復(fù)合益生菌酸奶。

3、商用β-半乳糖苷酶主要來(lái)源是真菌，如克魯維酵母和曲霉。米曲霉是β-半乳糖苷酶最重要的真菌來(lái)源，但該來(lái)源β-半乳糖苷酶的底物抑制作用和嗜酸的特性，阻礙了其在乳制品加工中的應(yīng)用。通過(guò)分子改造改善β-半乳糖苷酶的水解效率和酶學(xué)性質(zhì)，是提升β-半乳糖苷酶應(yīng)用適應(yīng)性的有效方法。段緒果等(中國(guó)專(zhuān)利號(hào)：zl202210560601.2)報(bào)道的β-半乳糖苷酶突變體的可溶性表達(dá)水平和熱穩(wěn)定性較野生型β-半乳糖苷酶有了明顯提高。喻曉蔚等(中國(guó)專(zhuān)利號(hào)：zl202210151251.4)所獲得的β-半乳糖苷酶突變的乳糖水解效率從野生型的42％提升至60％。

4、β-半乳糖苷酶的純化一般采用親和層析法，但該方法存在成本高以及由于多次洗滌而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白活性降低等問(wèn)題，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。在重組質(zhì)粒上插入功能特性高度可預(yù)測(cè)的蛋白標(biāo)簽修飾目的蛋白，可以提高突變體的相對(duì)酶活力和回收率，并簡(jiǎn)化純化步驟。addai等人將類(lèi)彈性蛋白肽基因序列與lactobacillus?sp.b164來(lái)源β-半乳糖苷酶基因序列連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒并在大腸桿菌中表達(dá)，融合蛋白回收率提高為傳統(tǒng)方法的2.1倍。

5、β-半乳糖苷酶在牛奶中應(yīng)用較多，低/零乳糖牛奶一般是在超高溫處理之后添加β-半乳糖苷酶生產(chǎn)的。胡志和(中國(guó)專(zhuān)利號(hào)：zl202011048475.x)在超高壓下使用乳糖酶水解乳糖制備得到低乳糖牛奶。在酸奶等發(fā)酵乳制品中，理想的β-半乳糖苷酶是在發(fā)酵過(guò)程中完成乳糖的水解。但是，發(fā)酵過(guò)程伴隨著體系ph的降低，因此要求β-半乳糖苷酶在ph4.5-ph?6.5范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。此外，乳糖是乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中的重要碳源，β-半乳糖苷酶的添加可能會(huì)對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)和代謝造成影響。研究表明，β-半乳糖苷酶的添加會(huì)影響乳酸菌的發(fā)酵特性和發(fā)酵風(fēng)味、延長(zhǎng)酸奶發(fā)酵時(shí)間或改變酸奶的質(zhì)構(gòu)特性。β-半乳糖苷酶水解速率過(guò)快會(huì)導(dǎo)致酸奶中碳水化合物組成快速改變，進(jìn)而影響發(fā)酵劑的生長(zhǎng)、代謝。但水解速率過(guò)慢會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束前乳糖含量無(wú)法到達(dá)零乳糖標(biāo)準(zhǔn)。所以為了滿(mǎn)足“零乳糖”乳制品的生產(chǎn)需求，通過(guò)分子改造優(yōu)化β-半乳糖苷酶的水解效率等酶學(xué)性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的高效表達(dá)，對(duì)其在乳品工業(yè)中的應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何優(yōu)化β-半乳糖苷酶的水解效率，提高微生物β-半乳糖苷酶的高效表達(dá)，生產(chǎn)新型零乳糖無(wú)蔗糖乳制品。

2、為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種米曲霉β-半乳糖苷酶突變體。

3、本發(fā)明提供的米曲霉β-半乳糖苷酶突變體，是將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的β-半乳糖苷酶aobgal35a第955位蘇氨酸t(yī)hr突變?yōu)榫彼醓rg得到的突變體蛋白質(zhì)。

4、所述突變體蛋白質(zhì)為t955r-aobgal35a。

5、上文中，所述突變體蛋白質(zhì)可為下述任一種：

6、a1)氨基酸序列是seq?id?no.2的蛋白質(zhì)；

7、a2)在a1)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)。

8、上述蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

9、上述蛋白質(zhì)中，所述蛋白標(biāo)簽(protein-tag)是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和/或純化。所述蛋白標(biāo)簽可為flag標(biāo)簽、his標(biāo)簽、mbp標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、gst標(biāo)簽和/或sumo標(biāo)簽等。

10、上文中，所述連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)具體可為氨基酸序列是seq?id?no.3的蛋白質(zhì)。

11、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化或點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列進(jìn)行突變。

12、上文所述的蛋白質(zhì)來(lái)源于米曲霉(aspergillus?oryzae)。

13、本發(fā)明還提供了與前文所述的蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料，所述生物材料可為下述中的任一種：

14、b1)編碼前文所述蛋白質(zhì)的核酸分子；

15、b2)含有b1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

16、b3)含有b1)所述核酸分子的重組載體；

17、b4)含有b2)所述表達(dá)盒的重組載體；

18、b5)含有b1)所述核酸分子的重組微生物；

19、b6)含有b2)所述表達(dá)盒的重組微生物；

20、b7)含有b3)所述重組載體的重組微生物；

21、b8)含有b4)所述重組載體的重組微生物。

22、上述生物材料中，b1)所述核酸分子可為如下任一所示的dna分子：

23、d1)核苷酸序列是seq?id?no.4所示的dna分子；

24、d1)核苷酸序列是seq?id?no.5所示的dna分子；

25、d3)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白的dna分子。

26、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反義rna。

27、本文所述載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒、噬菌體(如λ噬菌體或m13絲狀噬菌體等)、黏粒(即柯斯質(zhì)粒)、ti質(zhì)?；虿《据d體。具體可為載體ppic9k-t955r-aobgal35a和ppic9k-elp-t955r-aobgal35a。

28、上文中，所述重組微生物為重組酵母菌。

29、上文中，所述重組酵母菌為重組畢赤酵母菌。

30、上文中，所述重組畢赤酵母菌按照如下所述的方法構(gòu)建。

31、本發(fā)明中還提供了構(gòu)建重組畢赤酵母菌的方法，所述方法包括將上文任一所述的蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胨鍪荏w畢赤酵母菌。

32、上文中所述方法還包括將類(lèi)彈性蛋白肽(vpgvg)50標(biāo)簽連接到前文任一所述的蛋白質(zhì)的n端和/或c端，得到具有與前文任一所述的蛋白質(zhì)相同功能的融合蛋白質(zhì)。

33、本文中，所述導(dǎo)入可為通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法或電擊轉(zhuǎn)化法等任何已知的轉(zhuǎn)化方法將攜帶本發(fā)明dna分子的載體轉(zhuǎn)化宿主菌。導(dǎo)入的dna分子可以是單拷貝也可以是多拷貝。所述導(dǎo)入可以是將外源基因整合到宿主染色體中，也可以是由質(zhì)粒在染色體外表達(dá)。

34、本發(fā)明中還提供了米曲霉β-半乳糖苷酶突變體的制備方法，包括將前文任一所述的突變體編碼基因?qū)氲绞荏w微生物中，得到表達(dá)前文任一所述突變體的重組微生物，培養(yǎng)所述重組微生物，從所述發(fā)酵產(chǎn)物中得到米曲霉β-半乳糖苷酶突變體。

35、在一個(gè)具體實(shí)施例中，米曲霉β-半乳糖苷酶突變體的制備方法包括培養(yǎng)前文所述重組畢赤酵母菌，得到發(fā)酵產(chǎn)物，從所述發(fā)酵產(chǎn)物中得到米曲霉β-半乳糖苷酶突變體。

36、本發(fā)明所述的重組微生物在5l發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵，發(fā)酵液的酶活力達(dá)4628u/ml，高于大多數(shù)其他來(lái)源β-半乳糖苷酶在畢赤酵母的表達(dá)水平，如來(lái)源于極端嗜熱古菌硫礦硫化葉菌(sulfolobus?solfataricus，204.9u/ml)、亮白曲霉(aspergillus?candidus，3600u/ml)、節(jié)桿菌(arthrobacter?sp.，1926u/ml)及泡盛曲霉(aspergillus?awamori，347.8u/ml)等的β-半乳糖苷酶。

37、本發(fā)明中還提供了前文所述的方法或所述重組畢赤酵母菌在如下任一種應(yīng)用：

38、a)制備和生產(chǎn)低/無(wú)乳糖乳制品中的應(yīng)用；

39、b)制備和生產(chǎn)低/無(wú)蔗糖乳制品中的應(yīng)用；

40、c)在乳清加工中的應(yīng)用。

41、上文中，所述乳制品包括液體乳(巴氏殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳和乳酸菌飲料)；乳粉(全脂乳粉、脫脂乳粉、調(diào)制乳粉)。

42、上文中，所述低/無(wú)蔗糖乳制品是指利用前文所述的突變體蛋白質(zhì)水解乳品中天然或添加乳糖，從而得到更多游離單糖增加甜感、替代蔗糖。

43、本發(fā)明中還提供了一種零乳糖無(wú)蔗糖酸奶的制備方法，包括在原料乳中加入乳清粉，接種酸奶發(fā)酵劑時(shí)加入前文任一所述的突變體蛋白質(zhì)，得到零乳糖無(wú)蔗糖酸奶。

44、所述酸奶發(fā)酵劑為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌(yo-mix購(gòu)自丹尼斯克，貨號(hào)3625226)。

45、上述方法中，制備所述酸奶的基本原料為：生牛乳869-969份，乳清粉1-120份，乳糖酶1-10份，發(fā)酵劑0.01-1份。

46、上述方法中，所述突變體蛋白質(zhì)的加酶量為1-20u/ml。

47、上述方法中，所述乳清粉來(lái)源于乳制品加工副產(chǎn)物，乳糖含量不低于65％。

48、本發(fā)明將米曲霉來(lái)源的β-半乳糖苷酶aobgal35a第955位蘇氨酸t(yī)hr突變?yōu)榫彼醓rg，構(gòu)建得到突變體t955r。突變體在5l發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵，發(fā)酵液的酶活力達(dá)4628u/ml。在重組質(zhì)粒上插入類(lèi)彈性蛋白肽(vpgvg)50標(biāo)簽，利用其可逆的相變特性，突變酶回收率提高1.7倍。

49、與野生型相比，突變體最適ph由4.5提升至5.5、最適溫度由60℃下降至50℃，乳糖水解效率提高11％，更適用于低/零乳糖乳制品的生產(chǎn)工藝。添加乳清粉提高體系中乳糖含量，利用本發(fā)明突變酶水解出更多游離單糖增加甜感、替代蔗糖，制備得到酸甜適中、不添加甜味劑的低/無(wú)蔗糖乳制品。

50、本發(fā)明突變體的添加可以縮短零乳糖無(wú)蔗糖酸奶的發(fā)酵時(shí)間、提高酸奶活菌數(shù)并獲得高品質(zhì)酸奶。本發(fā)明突變酶制備的乳制品能夠滿(mǎn)足消費(fèi)者對(duì)低乳糖和低蔗糖乳制品的健康需求；此外還具有酸甜適中、口感醇厚和貨架期內(nèi)品質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明的米曲霉β-半乳糖苷酶突變體在乳品工業(yè)中具有良好應(yīng)用前景。