本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核菌株交配型的引物及方法。

背景技術(shù)：

1、暗褐脈柄牛肝菌(phlebopus?portentosus)是目前全世界范圍內(nèi)唯一一種實(shí)現(xiàn)了量產(chǎn)的牛肝菌物種，并已實(shí)現(xiàn)了工廠化栽培。人工栽培的暗褐脈柄牛肝菌口感嫩滑，風(fēng)味獨(dú)特，深受消費(fèi)者喜愛。近年的一些研究還發(fā)現(xiàn)，暗褐脈柄牛肝菌中富含各種有益成分，具有抗氧化、抗癌、抗病毒、提高免疫力、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)等多種活性，說明暗褐脈柄牛肝菌具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)潛力。

2、由于暗褐脈柄牛肝菌栽培年限較短，相關(guān)菌種選育工作還有待大力發(fā)展，以支持其市場需求遞增及人工栽培技術(shù)發(fā)展。其中，雜交育種是暗褐脈柄牛肝菌育種工作中的重要內(nèi)容之一。雜交育種的前提是同核菌株的交配型鑒定，傳統(tǒng)方法采取兩兩對峙培養(yǎng)，鏡檢鎖狀聯(lián)合的方法，工作量大，耗時(shí)長，觀察不全時(shí)易造成誤差，降低了雜交育種的效率。因此，開發(fā)快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核菌株交配型的方法，成為提高其育種效率的重要手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核菌株交配型的引物及方法，能夠快速準(zhǔn)確地鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核菌株交配型，從而提高雜交育種工作效率。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要提供如下技術(shù)方案：

3、一方面，本發(fā)明提供一種快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核體菌株交配型的引物，其特征在于，包括：第一引物對、第二引物對、第三引物對、第四引物對、第五引物對、第六引物對、第七引物對、第八引物對、第九引物對、第十引物對中的一對或多對；

4、所述第一引物對具有如序列表中seq?id?no.1和seq?id?no.2所示序列；

5、所述第二引物對具有如序列表中如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示序列；

6、所述第三引物對具有如序列表中如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示序列；

7、所述第四引物對具有如序列表中如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示序列；

8、所述第五引物對具有如序列表中如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示序列；

9、所述第六引物對具有如序列表中如seq?id?no.11和seq?id?no.12所示序列；

10、所述第七引物對具有如序列表中如seq?id?no.13和seq?id?no.14所示序列；

11、所述第八引物對具有如序列表中如seq?id?no.15和seq?id?no.16所示序列

12、所述第九引物對具有如序列表中如seq?id?no.17和seq?id?no.18所示序列

13、所述第十引物對具有如序列表中如seq?id?no.19和seq?id?no.20所示序列。

14、另一方面，本發(fā)明提供一種快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核體菌株交配型的試劑盒，所述試劑盒包括如上述引物的任意一對或多對。

15、另一方面，本發(fā)明提供一種快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核體菌株交配型的試紙條，所述試紙條包括述引物中任意一對或多對。

16、另一方面，本發(fā)明提供一種快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核體菌株交配型的方法，具體包括以下步驟：

17、s1：收集暗褐柄牛肝菌異核菌株，并通過有性孢子萌發(fā)得到對應(yīng)的同核菌株；

18、s2：收集步驟s1中異核菌株與同核菌株的菌絲體，并對菌絲體進(jìn)行基因組dna提取。

19、s3：以權(quán)利要求1中的10對引物對，對異核菌株的菌絲體dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測序。

20、s4：根據(jù)步驟s3中對異核菌株進(jìn)行pcr擴(kuò)增和測序的結(jié)果，在第一至第五引物對中選擇snp明顯的至少一對引物對作為交配型基因a位點(diǎn)鑒定的分子標(biāo)記引物，在第六至第十引物對中選擇snp明顯的至少一對引物對作為交配型基因b位點(diǎn)鑒定的分子標(biāo)記引物。

21、s?5：用步驟s?4中從第一至第五引物對中選取的引物對對待測同核菌株進(jìn)行pcr擴(kuò)增及交配型基因a位點(diǎn)鑒定測序，用步驟s?4中從第六至第十引物對中選取的引物對對待測同核菌株進(jìn)行pcr擴(kuò)增及交配型基因b位點(diǎn)鑒定測序，并根據(jù)測序結(jié)果中的snp分布對待測同核體菌株進(jìn)行交配型基因分型。

22、另一方面，本發(fā)明的快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核體菌株交配型的方法中，所述對菌絲體進(jìn)行基因組dna提取是通過使用高效植物基因組dna提取試劑盒對菌絲體進(jìn)行基因組dna提取。

23、另一方面，本發(fā)明的快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核體菌株交配型的方法中，所述對菌絲體進(jìn)行基因組dna提取是通過ctab法提?。辉揷tab法提取基因組dna具體步驟為：

24、t1：所述待測菌株的菌絲體中加入石英砂和250μl的2×ctab裂解液，研磨至勻漿狀，再加入600μl的2×ctab裂解液，顛倒混勻；

25、t2：置于65℃水浴1小時(shí)，且每10分鐘進(jìn)行翻轉(zhuǎn)；

26、t3：加入苯酚和氯仿各300μl，翻轉(zhuǎn)多次后，13000rpm離心10分鐘；然后收集上層水相；

27、t4：重復(fù)步驟s3多次，直至兩相界面上無沉淀；

28、t5：加入等體積的氯仿抽提一次，收集上層水相；

29、t6：加入0.5–1倍體積預(yù)冷的異丙醇或者2倍體積的無水乙醇，4℃下13000rpm離心10分鐘，棄除上清液；

30、t7：加入1ml預(yù)冷的75％乙醇，翻轉(zhuǎn)多次，13000rpm離心10分鐘，棄除上清液，重復(fù)兩次；

31、t8：置于室溫或真空系統(tǒng)中干燥；

32、t9：加入50μl無菌水室溫溶解，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

33、另一方面，本發(fā)明的快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核體菌株交配型的方法中，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：pcr?mix?45μl、正向引物2μl、反向引物2μl、dna模板1μl。

34、另一方面，本發(fā)明的快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核體菌株交配型的方法中，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：50ng/μl的模板1μl，25mm的mgcl2?5μl，10mm的dntps?1μl，6μm的引物各1μl，5u/μl的dnataq酶0.2μl，10×pcr反應(yīng)緩沖液5μl，去離子水35.8μl。

35、另一方面，本發(fā)明的快速鑒定暗褐脈柄牛肝菌同核體菌株交配型的方法中，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4～98℃預(yù)變性2min，接下來94～98℃變性10～30s，引物退火溫度10～30s，72℃延伸10～30s，一共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5～10min。

36、其中，各引物從seq?id?no.1至seq?id?no.20其退火溫度分別為58.0℃、57.7℃、56.0℃、54.4℃、55.3℃、54.9℃、57.3℃、55.4℃、54.2℃、55.4℃、55.8℃、56.3℃、54.9℃、56.3℃、58.1℃、59.9℃、58.5℃、56.1℃、54.7℃、57.1℃。