本發(fā)明具體涉及一種水稻etd1基因的編碼蛋白與應(yīng)用，屬于分子生物。

背景技術(shù)：

1、作物生產(chǎn)上病害嚴(yán)重，嚴(yán)重威脅糧食安全。以湖南省為例，2023年農(nóng)作物重大病蟲發(fā)生趨勢(shì)預(yù)報(bào)顯示：湖南地區(qū)紋枯病(4400萬畝次)、稻瘟病(330萬畝次)、稻曲病(300萬畝次)和南方水稻黑條矮縮病(50萬畝次)累計(jì)發(fā)生達(dá)5080萬畝次。由于主效抗性基因存在易受病原菌小種變化而喪失、地區(qū)限制、抗性成本以及分子育種上遺傳累贅等問題，水稻生產(chǎn)上主推品種抗性基因利用率低，亟待更好的廣譜持久抗病策略。此外，一些病害如紋枯病、稻曲病和南方水稻黑條矮縮病缺乏主效抗病基因的克隆及抗性品種選育，其防控主要依賴農(nóng)藥。因此提高作物對(duì)多種病原微生物的廣譜抗性能力同時(shí)減少農(nóng)藥使用已成為糧食生產(chǎn)綠色防控的必然需求。

2、以稻瘟病為例，水稻稻瘟病的病原菌屬于真菌門赤霉菌屬，這種真菌是一種有性繁殖和無性繁殖相結(jié)合的真菌，具有易感、高效、廣適應(yīng)性等特點(diǎn)。赤霉菌生長(zhǎng)在土壤中，可以通過植株根部吸收到水分和養(yǎng)分進(jìn)行繁殖。病原菌通過水稻植株的傷口或自然孔口(如氣孔)進(jìn)入水稻內(nèi)部后，大量繁殖并產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致水稻葉片出現(xiàn)梭形或橢圓形病斑。如果不及時(shí)控制，將嚴(yán)重影響水稻光合作用和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致水稻矮小、停止生長(zhǎng)直至死亡，因此稻瘟病也被稱為“水稻癌癥”。如果在稻瘟病爆發(fā)后，通過化學(xué)殺菌劑或生物農(nóng)藥的方式及時(shí)給予防治，停止生長(zhǎng)的水稻將會(huì)恢復(fù)生長(zhǎng)，直至在可控的時(shí)期內(nèi)將產(chǎn)量損失減少到最低。

3、在開展針對(duì)稻瘟病在內(nèi)的病害的水稻抗病分子設(shè)計(jì)育種工作中，最核心的是挖掘的抗病基因。水稻的免疫系統(tǒng)主要由病原分子相關(guān)模式觸發(fā)的免疫(pti)和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫(eti)構(gòu)成。前者通常被認(rèn)為能夠賦予植物廣譜并且持久的抗病性，后者則能夠賦予植物對(duì)特定病原小種的專化抗性。在生產(chǎn)實(shí)踐中，主效基因能夠顯著提高作物對(duì)特定病原小種的抗性，但這種抗性往往不能持久，當(dāng)新的病原小種出現(xiàn)后，主效基因的抗病效果隨即消失。因此，發(fā)掘廣譜抗病基因?qū)τ谒究共∮N具有更加重要的價(jià)值，也是植物抗病領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。但由于受鑒定及選育難度的限制，目前只有少數(shù)幾個(gè)水稻廣譜抗病基因及其分子機(jī)制被報(bào)道。

4、研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子不僅是細(xì)胞必要的礦質(zhì)元素同時(shí)又是必要的免疫激發(fā)的第二信使。免疫激活會(huì)觸發(fā)不同振幅和持續(xù)時(shí)間的鈣信號(hào)，這些鈣信號(hào)被各種鈣離子結(jié)合蛋白解碼從而調(diào)節(jié)下游防御反應(yīng)甚至是細(xì)胞死亡，因此免疫鈣信號(hào)建立是植物生物脅迫感知及應(yīng)答的核心環(huán)節(jié)，同時(shí)也是植物免疫研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。鈣信號(hào)受鈣離子通道調(diào)控，其中，植物環(huán)核苷酸門控通道蛋白(cngc)是鈣離子主要通道之一。研究表明，植物cngc參與了植物體內(nèi)的眾多生理過程，包括免疫反應(yīng)、花粉管萌發(fā)、伸長(zhǎng)和導(dǎo)向、氣孔運(yùn)動(dòng)以及根的向重力性等，這主要需要cngc介導(dǎo)的細(xì)胞鈣離子流動(dòng)的作用。

5、已知水稻全基因組包含16個(gè)cngcs(1-16)，分為4個(gè)家族(i-iv)和兩個(gè)亞家族(iv-a和iv-b)。oscngc13是水稻中首個(gè)被克隆的oscngcs家族成員，oscngc13的功能缺失影響授粉后花柱中鈣離子的積累、削弱了花柱細(xì)胞程序性死亡導(dǎo)致花粉管通道建成異常進(jìn)而引起水稻半不育。目前，還未發(fā)現(xiàn)涉及oscngc13的功能獲得性突變體的報(bào)道。

6、oscngc9是水稻中被克隆的第二個(gè)oscngcs家族成員，該基因?qū)λ久缙诘疚敛】剐跃哂姓蛘{(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，oscngc9是一個(gè)鈣離子通道蛋白。病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)下，水稻類受體激酶osrlck185可以與oscngc9互作，通過將其磷酸化從而激活鈣離子內(nèi)流積極調(diào)控活性氧爆發(fā)和pti相關(guān)基因的表達(dá)。因此oscngc9直接參與免疫鈣信號(hào)的調(diào)控。在冷脅迫條件下oscngc9介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流可以啟動(dòng)下游冷應(yīng)激反應(yīng)提升水稻耐冷性。王家昌(水稻免疫相關(guān)基因oscngc9的圖位克隆及功能分析和兩個(gè)水稻抽穗期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的功能研究，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2018)報(bào)道了發(fā)現(xiàn)來自oscngc9的水稻類病斑突變體cds1基因，研究表明野生型和突變體在分蘗期葉片無明顯差異。突變體在抽穗后葉片出現(xiàn)明顯的類病斑表型，并對(duì)稻瘟病的抗病性顯著降低。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，突變體中的第四個(gè)外顯子上出現(xiàn)了4bp堿基缺失，導(dǎo)致了翻譯的提前終止。突變體的類病斑表型和抗病能力下降均是由于oscngc9的突變導(dǎo)致的。轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明，增加oscngc9的轉(zhuǎn)錄可以一定程度上提高水稻對(duì)稻瘟病的廣譜抗性，然而該論文對(duì)oscngc9仍然屬于基礎(chǔ)研究工作，僅僅證明鈣離子通道oscngc9參與了植物的pti免疫，而病原菌可以利用效應(yīng)蛋白的進(jìn)化攻克這種抗性，在自然進(jìn)化中已經(jīng)出現(xiàn)了這一類病原菌，從而出現(xiàn)存在oscngc9基因，但水稻仍然是感病的。其次，該突變體是導(dǎo)致水稻對(duì)稻瘟病抗性明顯減弱，即這個(gè)表型和抗性不相關(guān)，該突變體不屬于獲得性功能突變體，因此不具備生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

7、此外，根據(jù)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有已知的類病斑突變體(參見上述論文第9-12頁(yè))有很多，涉及不同的基因調(diào)控。但是大部分類病斑表型調(diào)控基因涉及代謝相關(guān)調(diào)控基因，離子通道型突變的類病斑突變體鮮有報(bào)道。并且并非所有的類病斑突變體與稻瘟病或其類似疾病的抗性相關(guān)，導(dǎo)致對(duì)于相關(guān)的研究并未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。

8、從現(xiàn)有研究可知，oscngcs其他家族成員在免疫鈣信號(hào)中的調(diào)節(jié)作用值得進(jìn)一步深入研究。盡管從水稻以及其他植物中鑒定了多個(gè)cngc基因，并且也與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)關(guān)聯(lián)，然而其介導(dǎo)的抗性微弱，不具備生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

9、從檢索稻瘟病相關(guān)研究文獻(xiàn)資料表明，盡管有鈣離子通道蛋白相關(guān)基因?qū)Φ疚敛】剐蕴嵘膱?bào)道，但提升效果并不顯著。因此，目前需要一種新的鈣離子通道蛋白相關(guān)cngc基因突變體，該突變體針對(duì)稻瘟病菌應(yīng)當(dāng)具有廣譜抗性，從而提高水稻對(duì)不同稻瘟病生理小種抗病能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明第一原理是首次找到來自cngc13的超效等位基因突變體etd1基因的編碼蛋白，該編碼蛋白具有顯著加速細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的功能。

2、本發(fā)明第二原理是首次證明與類病斑表型相關(guān)的突變體etd1基因的編碼蛋白，其不但具有稻瘟病及其相似疾病的抗性，同時(shí)屬于oscngc13的超(效)等位基因。由于超等位基因是具備了新的功能，因此，可以利用該突變體使得基因敲除型植株獲得更強(qiáng)的鈣離子運(yùn)輸能力，具有顯著加速細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的功能，并增強(qiáng)植株對(duì)于稻瘟病及其相似疾病的抗性。

3、本發(fā)明第三原理是利用該etd1基因的編碼蛋白用于作物進(jìn)行遺傳改良，特別是對(duì)水稻對(duì)稻瘟病的抗性，可培育出廣譜抗稻瘟病水稻。具體而言，etd1是oscngc13的超效等位基因，但屬于隱性關(guān)系，oscngc13存在的條件下，etd1無法發(fā)揮功能。因此，需要將原有作物原有的oscngc13基因敲除，導(dǎo)入etd1，即可用于作物進(jìn)行遺傳改良，特別是對(duì)水稻對(duì)稻瘟病的抗性，可培育出廣譜抗稻瘟病水稻。

4、因此，本發(fā)明提供一種來自cngc13的突變體etd1基因的編碼蛋白，其具有如seqid?no.3所示的氨基酸序列，其中該蛋白的編碼基因?qū)儆趏scngc13的超效等位基因，其可使得基因敲除型或基因缺失型植株獲得更強(qiáng)的鈣離子運(yùn)輸能力，具有顯著加速細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的功能。

5、在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述編碼蛋白選自與seq?id?no.3所示的氨基酸序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白質(zhì)具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

6、在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)包括在n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)。

7、在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該蛋白具有調(diào)控水稻稻瘟病抗性、增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性的功能。

8、在上述任一實(shí)施方案中，所述etd1蛋白的編碼基因?qū)儆趏scngc13的超效等位基因，在基因敲除型植株中正常表達(dá)或過表達(dá)就能提高水稻抗性，因此具有正向調(diào)控水稻稻瘟病抗性。

9、在上述任一實(shí)施方案中，所述etd1蛋白的編碼基因?qū)儆趏scngc13的超效等位基因，在基因敲除型植株中正常表達(dá)或過表達(dá)就能提高水稻抗性，因此所述etd1蛋白的編碼基因在oscngc13基因敲除型或基因缺失型水稻中的表達(dá)受到抑制或者表達(dá)量降低，水稻的稻瘟病抗性降低。相比之下，來自oscngc9的水稻類病斑突變體cds1基因在水稻中的表達(dá)量增加，導(dǎo)致水稻的稻瘟病抗性降低。

10、技術(shù)效果

11、1、雖然現(xiàn)有的類病斑突變體有很多，涉及不同的基因調(diào)控。但是大部分類病斑表型調(diào)控基因涉及代謝相關(guān)調(diào)控基因，離子通道型突變的類病斑突變體鮮有報(bào)道。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)一種鈣離子通道的功能獲得型等位，在原有鈣離子通道的功能基礎(chǔ)上增強(qiáng)了通道的活性，并對(duì)基礎(chǔ)功能的通道進(jìn)行了定向進(jìn)化。本發(fā)明為利用免疫鈣信號(hào)提升植物抗病性提供了新解決途徑和實(shí)施例。

12、2、本發(fā)明生物誘導(dǎo)突變技術(shù)，首次獲得來自oscngc13基因的突變體etd1蛋白，該突變位于loc_os06g10580基因的第七個(gè)外顯子上產(chǎn)生了g-a的變異引起氨基酸的改變(圖3b)。

13、3、本發(fā)明首次證明與類病斑表型相關(guān)的突變體etd1基因的編碼蛋白，其不但具有稻瘟病及其相似疾病的抗性，同時(shí)屬于oscngc13的超(效)等位基因。由于超等位基因是具備了新的功能，因此，可以利用該突變體使得基因敲除型植株獲得更強(qiáng)的鈣離子運(yùn)輸能力，具有顯著加速細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的功能，并增強(qiáng)植株對(duì)于稻瘟病及其相似疾病的抗性。

14、4、本發(fā)明首次證明該氨基酸的單位點(diǎn)突變，能夠顯著提高水稻對(duì)稻瘟病的抗性。

15、5、本發(fā)明首次證明etd1蛋白屬于編碼鈣離子通道蛋白的突變體，其可以顯著加速細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的能力；

16、6、本發(fā)明首次證明該etd1基因?qū)儆趏scngc13的超(效)等位基因，但屬于隱性關(guān)系，oscngc13存在的條件下，etd1無法發(fā)揮功能。因此，需要將原有作物原有的oscngc13基因敲除，導(dǎo)入etd1，即可用于作物進(jìn)行遺傳改良，特別是對(duì)水稻對(duì)稻瘟病的抗性，可培育出廣譜抗稻瘟病水稻；

17、7、本發(fā)明提供了一種利用該etd1基因及其編碼蛋白，及其相關(guān)生物元件用于培育高抗稻瘟病水稻品種的方法，也為培育水稻稻瘟病抗性種質(zhì)提供了新的基因資源，有利于水稻稻瘟病抗性品種選育，從而保障水稻生產(chǎn)的安全；

18、8、由于野生型宿主中不含etd1基因，且本發(fā)明證明不需要提高etd1的表達(dá)或表達(dá)量，只需要將該基因?qū)隿ngc13基因敲除型或基因缺失型宿主中獲得更強(qiáng)的鈣離子運(yùn)輸能力，具有顯著加速細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的功能，即可提高宿主抗稻瘟病的能力。

19、9、本發(fā)明首次證明etd1在稻瘟病菌的刺激下，會(huì)導(dǎo)致cngc13基因敲除型或基因缺失型的葉片細(xì)胞死亡程度明顯超過野生型，但這種反應(yīng)機(jī)制實(shí)質(zhì)有利于宿主抵抗外來病菌的入侵，建立有效的免疫防御機(jī)制。一旦度過了外來病菌的侵入期，在通過后期提供合理營(yíng)養(yǎng)、光照等條件，在不存在稻瘟病菌的情況下，轉(zhuǎn)基因水稻的后續(xù)生長(zhǎng)又基本上或完全恢復(fù)了正常生長(zhǎng)，并對(duì)產(chǎn)量基本上沒有影響。相比之下，在同一田間、同一生長(zhǎng)時(shí)期的野生型株系，在接種稻瘟菌之后，基本上全部枯萎直至死亡。因此，預(yù)示著本發(fā)明將etd1回補(bǔ)到cngc13基因敲除型或基因缺失型宿主中，可以開發(fā)抵抗多種作物病害的轉(zhuǎn)基因作物，具有廣泛的生產(chǎn)應(yīng)用前景。