本發(fā)明涉及脊髓類器官的培養(yǎng)，具體涉及一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架材料。

背景技術(shù)：

1、類器官是由干細(xì)胞在體外培養(yǎng)而自組織形成三維組織結(jié)構(gòu)，可模擬體內(nèi)特定組織器官的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和部分生理功能。其中脊髓類器官不僅克服了傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)無法復(fù)制天然脊髓復(fù)雜表型的局限性，而且解決了人和動物模型之間種屬發(fā)育差異的問題。因此，脊髓類器官為研究脊髓發(fā)育生物學(xué)、疾病建模、藥物篩選和神經(jīng)再生提供了極好的平臺。得益于方法學(xué)的巨大進(jìn)步，目前脊髓類器官已經(jīng)越來越接近體內(nèi)脊髓組織的表型。脊髓類器官從最初僅表現(xiàn)為極化上皮囊腔樣的結(jié)構(gòu)，到同時包含腹背側(cè)主要神經(jīng)元類型的神經(jīng)管類器官，再到目前包含神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和突觸的復(fù)雜表型脊髓類器官，不僅具有一定的電生理功能，還可以體外復(fù)現(xiàn)神經(jīng)管折疊的動態(tài)過程。

2、培養(yǎng)脊髓類器官需要精確調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生信號，來誘導(dǎo)物理分離和表型規(guī)范。在傳統(tǒng)方案中，這些事件是通過在特定時間點添加外源形態(tài)形成因子來完成的，形態(tài)因子和細(xì)胞分泌的可溶性成分自發(fā)分散在培養(yǎng)環(huán)境中產(chǎn)生生化梯度，然而，模擬體內(nèi)器官發(fā)生所需的梯度是具有挑戰(zhàn)性的。然而，由于其自發(fā)性質(zhì)，這些梯度不容易控制，并且通常無法模擬體內(nèi)器官發(fā)生過程中對組織模式至關(guān)重要的漸變形態(tài)原分布。

3、在脊髓發(fā)育過程中，形成了三個軸：前-后(ap)/喙-尾軸，背-腹側(cè)(dv)軸和內(nèi)側(cè)-外側(cè)軸。ap軸是同源盒(hox)基因的重疊表達(dá)圖譜。hox基因家族由四個簇組成：hoxa、hoxb、hoxc和hoxd，分別位于染色體7、17、12和2上?；谛蛄邢嗨菩?，這些基因可進(jìn)一步分為13個同源群(hox?1-13)，它們沿ap軸在不同區(qū)域表達(dá)。細(xì)胞身份由宮頸組織中的hox4-7基因、胸腔組織中的hox8-9基因和腰椎組織中的hox10-11基因決定。兩種相反的機(jī)制控制hox基因的表達(dá)譜。在發(fā)育過程中，ra誘導(dǎo)hox4-7基因的表達(dá)以促進(jìn)宮頸細(xì)胞的身份，而fgf誘導(dǎo)胸腔hox8-9基因的表達(dá)以促進(jìn)后分化。fgf和生長分化因子11都需要建立最后細(xì)胞身份。dv軸的形成決定了運動和體感細(xì)胞的特性。在神經(jīng)管關(guān)閉過程中，shh促進(jìn)了腹側(cè)模式，這是脊索和底板分泌的一種因子。另一方面，背側(cè)圖案是由屋頂板分泌的bmp和wnt家族蛋白促進(jìn)的。相反的shh和bmp/wnt梯度產(chǎn)生交叉抑制轉(zhuǎn)錄相互作用，并誘導(dǎo)11個離散祖結(jié)構(gòu)域的形成，包括5個腹側(cè)結(jié)構(gòu)域(p0-p3和pmn結(jié)構(gòu)域)，它們分化為負(fù)責(zé)運動協(xié)調(diào)的神經(jīng)元群體，以及6個背側(cè)結(jié)構(gòu)域(dp1-dp6)，它們分化為本體感覺和感覺神經(jīng)元。每個結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)祖細(xì)胞表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄因子，形成一個交叉調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)，決定了它們對形態(tài)因子的反應(yīng)。內(nèi)側(cè)軸是神經(jīng)祖細(xì)胞徑向遷移和分化形成的。在dv軸的圖像化過程中，室管膜層中的增殖祖細(xì)胞在細(xì)胞分化過程中遷移到最終沉降位置，形成套膜層。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架材料，制備的支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架有導(dǎo)電性，能產(chǎn)生沿著生物支架長度的濃度梯度。

2、本發(fā)明的目的之二在于提供一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架，該生物支架能模擬沿前后軸(ap)的模式與背腹軸(dv)模式同時發(fā)生的關(guān)于四種相反且正交的形態(tài)發(fā)生信號(shh、bmp、ra和wnt/fgf)的濃度梯度。

3、本發(fā)明的目的之三在于提供一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架的制備方法，該方法制備生物支架的簡單方便，可靠。

4、本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架的使用方法，用該生物支架能培養(yǎng)出脊髓類器官，具備血管化的過程。

5、本發(fā)明的目的之一采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

6、一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架材料，所述生物支架材料包括打印基質(zhì)材料、生物相容性和生物可降解導(dǎo)電材料、所述生物相容性和生物可降解導(dǎo)電材料為親水性基團(tuán)改性的聚吡咯、聚(3,4-乙烯二氧噻吩)、導(dǎo)電水凝膠、導(dǎo)電絲素中的一種；所述打印基質(zhì)材料是將質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為7.5％的甲基丙烯?；髂zgelma、體積分?jǐn)?shù)為25％的聚乙二醇二丙烯酸酯和體積分?jǐn)?shù)為0.225％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰、質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5.2％的肝素微球混合在dulbecco的磷酸鹽緩沖鹽水溶液中制成的。

7、進(jìn)一步地，所述肝素微球的制備方法包括以下步驟：

8、s1、肝素溶液配制：將肝素溶解在去離子水中，配制成一定濃度的肝素溶液；

9、s2、微球制備：采用乳化-溶劑蒸發(fā)法或噴霧干燥法技術(shù)，將肝素溶液與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(plga)溶液混合，通過攪拌和超聲，形成肝素負(fù)載的微球；

10、s3、微球固化與收集：將肝素負(fù)載的微球進(jìn)行固化處理，如在室溫下干燥或在低溫下冷凍干燥，以去除溶劑并穩(wěn)定微球結(jié)構(gòu)，然后通過過濾或離心收集肝素負(fù)載的微球。

11、本發(fā)明的目的之二采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

12、一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架，所述生物支架是由權(quán)利要求1或2所述的所述生物支架材料經(jīng)由3d打印技術(shù)制造的，所述生物支架是中空管狀結(jié)構(gòu)，所述生物支架的截面被打印成天然脊髓相似的形態(tài)，包括前正中裂部分和后正中溝部分，所述生物支架沿著徑向管壁外包括多層，所述前正中裂部分從管壁外層到管壁內(nèi)層中包含梯度濃度下降的嘌呤胺(shh激動劑，cayman?chemical)，所述后正中溝部分從管壁外層到管壁內(nèi)層中包含梯度濃度下降的bmp4(r&d?systems)；所述生物支架的一端沿長度方向設(shè)置有孔徑由大到小的孔徑梯度，所述生物支架的另外一端沿長度方向也設(shè)置有孔徑由大到小的孔徑梯度，所述生物支架的一端的管壁內(nèi)結(jié)合有維甲酸(sigma)，所述生物支架的另外一端的管壁內(nèi)結(jié)合有成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)/wnt。

13、進(jìn)一步地，維甲酸(sigma)和成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)/wnt的結(jié)合方法如下：配制成濃度5ug/ml的維甲酸(sigma)溶液和濃度5ug/ml成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)/wnt溶液，將所述維甲酸(sigma)溶液和所述成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)/wnt溶液依次涂覆在3d生物打印機(jī)打印的生物支架的兩端內(nèi)壁上，涂覆后，室溫下放置3小時，用ph為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)清洗所述3d生物打印機(jī)打印的生物支架三次，去除游離的未被固定的生長因子。

14、本發(fā)明的目的之三采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

15、一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架的制備方法，包括以下步驟：

16、s1、使用計算機(jī)輔助設(shè)計(cad)軟件創(chuàng)建支架的三維模型，將三維模型導(dǎo)入切片軟件，該軟件將模型分割成一系列薄層；

17、s2、使用具有多個噴頭的3d生物打印機(jī)，每個噴頭可以分別裝載不同濃度的嘌呤胺和不同濃度的bmp4，作為生物墨水，按照預(yù)設(shè)的路徑和順序逐層打印，實現(xiàn)分別在前正中裂部分和后正中溝部分徑向方向上不同層的濃度梯度；

18、s3、配制成濃度5ug/ml的維甲酸(sigma)溶液和濃度5ug/ml成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)/wnt溶液，將所述維甲酸(sigma)溶液和所述成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)/wnt溶液依次涂覆在3d生物打印機(jī)打印的生物支架的兩端內(nèi)壁上，涂覆后，室溫下放置3小時，用ph為7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)清洗所述3d生物打印機(jī)打印的生物支架三次，去除游離的未被固定的生長因子，得到所述用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架。

19、進(jìn)一步地，。

20、本發(fā)明的目的之四采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

21、一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架的使用方法，包括以下步驟：

22、s1、培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因hb9::gfp報告基因構(gòu)建的小鼠胚胎干細(xì)胞(mescs)和血管內(nèi)壁細(xì)胞，將所述轉(zhuǎn)基因hb9::gfp報告基因構(gòu)建的小鼠胚胎干細(xì)胞(mescs)和所述血管內(nèi)壁細(xì)胞混合在一起，將培養(yǎng)的細(xì)胞與matrigel基質(zhì)混合，用移液槍頭使所述培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮于所述matrigel基質(zhì)中，加入終濃度為5.0-7.5ng/ml的血管內(nèi)皮生長因子；

23、s2、然后灌注到所述用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架中，所述用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架置于脊髓類器官芯片模型中進(jìn)行生長和分化，形成脊髓類器官。

24、相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

25、(1)本發(fā)明提供的一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架材料，用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架的材料包含生物相容性和生物可降解導(dǎo)電材料，制備的支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架有導(dǎo)電性，培養(yǎng)的脊髓類器官能夠全面模擬脊髓的電生理功能。支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架材料中含有肝素微球，用該材料打印的支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架表面結(jié)合有肝素微球。

26、(2)本發(fā)明提供的一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架，所述生物支架的截面被打印成天然脊髓相似的形態(tài)，包括前正中裂部分和后正中溝部分，所述生物支架沿著徑向管壁外包括多層，所述前正中裂部分從管壁外層到管壁內(nèi)層中包含梯度濃度下降的嘌呤胺，所述后正中溝部分從管壁外層到管壁內(nèi)層中包含梯度濃度下降的bmp4，能模擬體內(nèi)化學(xué)梯度的生理環(huán)境腹側(cè)到背側(cè)中shh、bmp相反的濃度梯度；所述生物支架的一端沿長度方向設(shè)置有孔徑由大到小的孔徑梯度，所述生物支架的另外一端沿長度方向也設(shè)置有孔徑由大到小的孔徑梯度，所述生物支架的一端的管壁內(nèi)結(jié)合有維甲酸(sigma)，所述生物支架的另外一端的管壁內(nèi)結(jié)合有成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)/wnt，由于生物支架的孔徑梯度和表面積梯度呈現(xiàn)相反的趨勢，將生物活性信號ra和wnt/fgf固定在表面積(孔徑)梯度支架的表面，就很容易獲得生ra和wnt/fgf的梯度支架，用該材料打印的支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架表面結(jié)合有肝素微球，肝素與涂覆到管壁的ra和wnt/fgf可逆結(jié)合，固定在管壁內(nèi)，能模擬體內(nèi)化學(xué)梯度的生理環(huán)境前后側(cè)中ra和wnt/fgf相反的濃度梯度；

27、在脊髓的表面，有前后兩條正中縱溝，將脊髓分為對稱的兩半，前面的溝稱為前正中裂(anterior?median?fissure)，較深；后面的溝稱為后正中溝(posterior?mediansulcus)，較淺，脊髓的前正中裂(anteriormedian?fissure)位于脊髓的腹側(cè)(ventralside)；脊髓的后正中溝(posteriormedian?sulcus)位于脊髓的背側(cè)(dorsal?side)，沿前后軸(ap)的模式與背腹軸(dv)模式同時發(fā)生的關(guān)于四種相反且正交的形態(tài)發(fā)生信號(shh、bmp、ra和wnt/fgf)的濃度梯度，來模擬體內(nèi)化學(xué)梯度的生理環(huán)境，從而使大多細(xì)胞可以感受這種濃度梯度，產(chǎn)生相應(yīng)行為，能夠模擬在神經(jīng)管發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)空間和時間化學(xué)環(huán)境，發(fā)育形態(tài)因子的同時對立和/或正交梯度可以維持，從而產(chǎn)生類似于在體內(nèi)觀察到的神經(jīng)管模式，有助于支持脊髓類器官的生長和分化。

28、(4)本發(fā)明提供的一種用于脊髓類器官芯片模型中支持脊髓類器官的生長和分化的生物支架的使用方法，將所述轉(zhuǎn)基因hb9::gfp報告基因構(gòu)建的小鼠胚胎干細(xì)胞(mescs)和所述血管內(nèi)壁細(xì)胞混合在一起，共培養(yǎng)，培養(yǎng)出脊髓類器官具備血管化的過程。