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一種使用無標記RNaseH探針和LC-MS對mRNA進行加帽率分析的方法與流程

文檔序號:41948743發(fā)布日期:2025-05-16 14:06閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:

2.根據權利要求1所述的一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于:所述步驟s100和步驟s200中的rna為mrna。

3.根據權利要求1所述的一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于:所述步驟s100中的不加帽rna通過t7聚合酶體外轉錄制備。

4.根據權利要求1所述的一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于:所述步驟s200中的加帽rna的帽狀結構為cap?0、capⅰ、capⅱ型結構中的一種;所述加帽rna通過酶法加帽或者共轉錄加帽制備。

5.根據權利要求1所述的一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于:所述步驟s300中的純化方式為磁珠純化、柱純化、酚/氯仿純化或氯化鋰純化。

6.根據權利要求1所述的一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于:所述步驟s400中的待測rna?5’utr為rna自5’序列開始第1~53nt堿基序列;所述探針形式為rna片段10~20nt+dna片段4~6nt,rnase?h探針無任何修飾,所述待測rna與rnase?h探針的比例為1:1~1:10。

7.根據權利要求1所述的一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于:所述步驟s500中變性為在85~95℃變性1~10min;所述退火為依次在65℃持續(xù)2min、55℃持續(xù)2min、45℃持續(xù)2min、37℃持續(xù)2min、30℃持續(xù)2min、22℃持續(xù)2min。

8.根據權利要求1所述的一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于:所述步驟s600中的rna水解酶為rnase?h、rnase?hⅰ和rnase?hⅲ中的一種;所述rna水解酶反應溫度為20~37℃,反應時間為0~3h。

9.根據權利要求1所述的一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于:所述步驟s600中的混合切割片段包括未參與反應的全長rna、長3’切割產物、加帽的短5’切割產物、未加帽的短5’切割產物和rnase?h探針。

10.根據權利要求1所述的一種使用無標記rnase?h探針和lc-ms對mrna進行加帽率分析的方法,其特征在于:所述步驟s700中所述的混合短片段為加帽的短5’切割產物、未加帽的短5’切割產物和rnase?h探針。


技術總結
本發(fā)明的一種使用無標記RNase?H探針和LC?MS對mRNA進行加帽率分析的方法,屬于生物技術領域。根據待檢測RNA序列設計DNA?RNA探針,利用RNase?H的特異性切割RNA分子,通過硅膠柱的特異性吸附分離出短片段,并利用LC?MS的方法檢測剪切后的RNA產物的分子量大小以及相對比例,從而測定加帽效率,實現(xiàn)了定量檢測RNA加帽效率,能夠避免放射性污染,且操作簡單、成本低。

技術研發(fā)人員:張貴霖,王珍珍,崔月,陸昌瑞
受保護的技術使用者:上海麥野生物科技有限公司
技術研發(fā)日:
技術公布日:2025/5/15
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