本發(fā)明屬于基因檢測，具體的說，涉及一種g6pd基因啟動子區(qū)的dna擴增引物及其甲基化檢測方法。

背景技術(shù)：

1、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate?dehydrogenase,g6pd)缺乏癥是一種x連鎖不完全顯性遺傳病，g6pd作為戊糖磷酸途徑中的關(guān)鍵限速酶，負責催化還原型輔酶ii和6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯的生成。還原型輔酶ii在維持細胞內(nèi)還原狀態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，有助于抵抗氧化損傷。在中國，g6pd缺乏癥的分布呈現(xiàn)南方發(fā)病率普遍高于北方的特點，其中兩廣和云南等地區(qū)是高發(fā)區(qū)。這種分布特征可能與地理環(huán)境、遺傳背景和歷史人口遷移等因素有關(guān)。該病的流行與地理分布與瘧疾流行地區(qū)緊密相關(guān)，可能與預(yù)防瘧疾感染有關(guān)，但其具體機制尚待進一步研究。g6pd基因廣泛表達于人體各種細胞中，但在不同組織中的表達濃度存在差異。該基因位于x染色體的xq28位置，全長約20114bp，包含13個外顯子和12個內(nèi)含子。其cdna編碼區(qū)長1.5kb，可編碼515個氨基酸。g6pd基因的5'端非編碼區(qū)富含gc序列，至少含有9個gc盒，這些gc盒是啟動子的必需元素。

2、g6pd缺乏癥的臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性，其臨床癥狀例如：無癥狀、新生兒黃疸、藥物或感染引起的急性溶血、蠶豆病和重癥慢性非球形紅細胞溶血性貧血等。在臨床實踐中，接觸特定誘因后，男性半合子和女性純合子攜帶者可能會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥。例如，受環(huán)境因素影響暴露于某些藥物、感染或食物中的特定化學物質(zhì)，可能導致這些男性患兒出現(xiàn)溶血性貧血等癥狀。而對于女性雜合子攜帶者，她們可能終身不發(fā)病，即使在接觸誘因的情況下，也可能不會出現(xiàn)溶血等癥狀，她們的g6pd酶活性表現(xiàn)出較大的變異性。

3、g6pd基因的表達受到多種因素的調(diào)控，x染色體失活(x?chromosomeinactivation，xci)與g6pd雜合子的酶活性表達的差異性密切相關(guān)。在x染色體失活過程中，異常的dna甲基化作用，特別是x連鎖基因啟動子區(qū)域的cpg島甲基化，對g6pd基因包括其它x染色體上的基因的失活起到了重要的調(diào)控作用。這些發(fā)現(xiàn)為我們理解g6pd缺乏癥的分子機制提供了新的視角。

4、dna甲基化作為一種關(guān)鍵的表觀遺傳修飾機制，扮演著至關(guān)重要的角色。dna甲基化的甲基化過程中，特別是在基因啟動子區(qū)域，可以導致基因表達的抑制。由于xci過程中的甲基化模式可能在不同細胞和組織中存在變異，這可能導致x連鎖隱性疾病表型在攜帶者中的不完全滲透性，即攜帶者在某些情況下可能表現(xiàn)出輕微到中等程度的疾病癥狀。甲基化水平的個體間的差異也可能影響疾病的表達，使得即使是在遺傳信息相同的情況下，疾病的嚴重程度和表現(xiàn)形式也可能有所不同。

5、在基因組中，cpg二核苷酸隨機分布，其中大部分發(fā)生甲基化。然而，一部分cpg二核苷酸聚集在甲基化水平較低的cpg島(cpg?island，cgi)中。盡管對cgi的確切定義仍有爭議，但通常認為cgi是一個區(qū)域，長度超過200個堿基對，cg二核苷酸比例超過50％。cgi中的cpg位點大多處于非甲基化狀態(tài)，這一特性有助于該區(qū)域避免5-甲基胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?。cgi廣泛存在于脊椎動物基因組中超過一半的基因中，通常富集在基因啟動子區(qū)域，并經(jīng)常與轉(zhuǎn)錄起始位點重疊，其過度甲基化通常與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。

6、dna甲基化對啟動子和遠端調(diào)控區(qū)域內(nèi)基因表達的控制，涉及多種機制。

7、基于亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理的dna甲基化檢測是一種廣泛使用的方法，主要用于檢測dna序列中的甲基化程度。這種技術(shù)依賴于亞硫酸鹽處理dna樣本的能力，將未甲基化的胞嘧啶(c)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(u)，而甲基化的胞嘧啶在后續(xù)pcr中進而轉(zhuǎn)錄為腺嘌呤(t)，而甲基化的胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶)一直保持不變。通過后續(xù)的pcr擴增及序列分析，可以區(qū)分哪些胞嘧啶被甲基化，從而了解特定dna序列區(qū)域的甲基化模式?；趤喠蛩猁}轉(zhuǎn)化技術(shù)又可以分為msp技術(shù)對dna序列的甲基化情況進行定性檢測，和bsp對dna序列的甲基化情況進行定量檢測。

8、其中，bsp實驗原理：利用特定的引物對亞硫酸鹽處理后的dna進行pcr擴增。這些引物設(shè)計用來結(jié)合轉(zhuǎn)化后的dna序列，pcr擴增的產(chǎn)物通常被克隆到細菌中，以便選擇單個克隆進行測序，也有研究對pcr擴增產(chǎn)物進行直接測序。通過測序分析，可以確定每個胞嘧啶位置上的甲基化狀態(tài)。bsp技術(shù)具有高分辨率，無需特殊引物(不需要設(shè)計區(qū)分甲基化和未甲基化狀態(tài)的特異性引物)，廣泛適用等優(yōu)點。但現(xiàn)有的bsp單堿基分辨率的甲基化定量檢測中，亞硫酸鹽對dna進行預(yù)處理，dna會碎片化導致檢測序列不長，普遍為100bp且大部分樣本pcr后不能進行直接測序檢測，需提純pcr產(chǎn)物后再構(gòu)建相應(yīng)的質(zhì)粒進行測序，這無疑極大的增加了每個樣本的檢測成本。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種g6pd基因啟動子區(qū)的dna擴增引物及其甲基化檢測方法，用本發(fā)明所設(shè)計的引物對待測基因組dna進行pcr擴增，可顯著增加擴增產(chǎn)物的長度,擴增后的檢測片段長達251bp，能夠覆蓋28個cg島，不需要純化即可直接測序；本發(fā)明所提供的檢測方法，大大減少了檢測工作量，對于研究g6pd基因的表觀遺傳學具有重要意義。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、所述的g6pd基因啟動子區(qū)dna的pcr擴增引物的序列如seq?id?no.1和seq?idno.2所示。

4、利用上述引物進行g(shù)6pd基因啟動子區(qū)dnapcr擴增，擴增程序為，95℃預(yù)變性30s；98℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s；變性-退火-延伸45個循環(huán)；72℃終延伸10min。

5、所述的g6pd基因啟動子區(qū)甲基化檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

6、(1)對提取的dna進行甲基化處理，得到經(jīng)過甲基化處理的待測基因組dna；

7、(2)以步驟(1)的待測基因組dna為模板，進行pcr擴增，pcr擴增引物如seq?idno.1和seq?id?no.2所示。

8、(3)檢測pcr擴增產(chǎn)物，對有擴增產(chǎn)物的樣本進行測序，并對測序結(jié)果進行比對，判斷每個cpg位點的甲基化情況。

9、進一步的，步驟(1)提取的dna來自離體人體組織的dna，具體為人外周血和/或其他脫落組織細胞。

10、進一步的，步驟(1)所述甲基化處理為亞硫酸氫鹽甲基化處理；處理輸入的dna濃度為每樣本20微升體系500ng?dna，dna變性和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化溫度時間為98℃/10分鐘變性，60℃/150分鐘轉(zhuǎn)化。

11、進一步的，步驟(2)所述pcr擴增的程序為，95℃預(yù)變性30s，98℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s；變性-退火-延伸45個循環(huán)；72℃終延伸10min；最后4℃低溫保存。

12、進一步的，步驟(3)所述pcr擴增產(chǎn)物檢測為瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測時的瓊脂糖的濃度為1.0％，電泳時電壓150v，時間20min。

13、進一步的，步驟(3)所述測序結(jié)果的比對，具體為一代測序結(jié)果與人類基因組序列即jan.2022(t2t?chm13v2.0/hs1)進行單堿基比對，對每個樣本的第1號-第28號cpg位點進行逐個判別，以測序峰圖為準，對于雙峰，c與t峰強小于等于1：1判定為t；峰強大于等于2：1判定為c，隨后對照g6pd基因原始cg堿基序列，與之對應(yīng)的測序結(jié)果tg堿基序列判斷為該cpg位點為未甲基化cpg位點，測序結(jié)果依然為cg堿基序列的則判斷為甲基化cpg位點。

14、進一步的，每個cpg位點的甲基化情況的判定方法和判斷標準分別為：

15、判斷方法：以甲基化率判斷甲基化情況，甲基化率的計算公式為：

16、

17、甲基化判斷標準：

18、當g6pd基因啟動子dna甲基化率≥97.22％時，判定為高甲基化狀態(tài)；

19、當g6pd基因啟動子dna甲基化率≤90.21％時，判定為低甲基化狀態(tài)；

20、當g6pd基因啟動子90.21％<甲基化率<97.22％時，判定為中間狀態(tài)。

21、本發(fā)明的有益效果：

22、用本發(fā)明所設(shè)計的引物對待測基因組dna進行pcr擴增，可顯著增加擴增產(chǎn)物的長度,擴增后的檢測片段長達251bp，不需要純化即可直接測序。

23、本發(fā)明利用bsp技術(shù)對dna序列進行甲基化檢測，對甲基化處理后的dna使用本發(fā)明所設(shè)計的引物進行pcr擴增，使得檢測片段長達251bp，能夠覆蓋28個cg島，pcr擴增后不需要純化即可直接測序，無需構(gòu)建樣本序列質(zhì)粒，大大減小了檢測工作量，對于研究g6pd基因的表觀遺傳學具有重要意義。