本發(fā)明涉及一種植物多糖的提取分離與純化工藝方法，具體而言，涉及一種具有抗氧化活性結(jié)構(gòu)表征的竹葉柴胡多糖制備方法。

背景技術(shù)：

1、竹葉柴胡（ bupleurum?marginatum?wall.?ex?dc.）是一種傳統(tǒng)的中藥材，屬于傘形科柴胡屬植物，其獨(dú)特的藥用價值和應(yīng)用前景一直備受關(guān)注。主要分布于四川北部、陜西南部、湖北西部、云南、貴州及甘肅等地區(qū)。竹葉柴胡的藥用歷史悠久，以全草入藥，味辛、苦，性微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具解表和里、疏肝解郁、提升中氣之功效。常用于治療感冒發(fā)熱、寒熱往來、胸脅脹痛、瘧疾、子宮下垂、月經(jīng)不調(diào)等多種疾病。除了傳統(tǒng)的藥用功效外，竹葉柴胡還具有抗脂肪肝、抗肝損傷、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性。這些藥理作用的發(fā)現(xiàn)，為竹葉柴胡在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更為廣闊的空間，使其成為新藥研發(fā)、疾病治療等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。竹葉柴胡含有皂苷、甾醇、多糖、黃酮等生物活性成分，在竹葉柴胡的多種活性成分中，多糖作為一類重要的生物大分子，占據(jù)了重要地位。

2、通過深入研究竹葉柴胡多糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、生物活性及其作用機(jī)制，不僅可以為竹葉柴胡的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，還可以為新藥研發(fā)、疾病治療等領(lǐng)域提供新的思路和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗氧化活性的竹葉柴胡多糖制備方法。該方法采用熱水回流提取法，從竹葉柴胡植物中得到粗提物，提取液經(jīng)過濾與預(yù)處理去除雜質(zhì)，包括小分子、蛋白質(zhì)及色素成分，以提高純度。利用deae-52纖維素柱分離，用去離子水和0.1mol/l至1?mol/l的nacl溶液洗脫，之后通過sephadex?g-200凝膠柱層析法進(jìn)一步純化，最終得到1個竹葉柴胡多糖bmp-1。為進(jìn)一步確定所獲得竹葉柴胡多糖的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，采用多種分析技術(shù)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。包括但不限于紅外光譜（ftir）、高效液相色譜（hplc）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gc-ms）、甲基化修飾以及核磁共振（nmr）波譜等。通過體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，評估所獲得的竹葉柴胡多糖（bmp-1）的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該多糖具有一定的抗氧化能力，能夠有效清除自由基，抑制氧化損傷。

2、本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、本發(fā)明一種具有抗氧化活性的竹葉柴胡多糖制備方法，具體步驟如下：

4、（1）提取過程：首先，通過石油醚對竹葉柴胡藥材進(jìn)行回流提取，以去除脂類物質(zhì)。采用藥材與溶劑的質(zhì)量比為1:10（g/ml），回流提取3次，每次2小時。藥渣晾干后，使用70?%乙醇進(jìn)行提取，比例同樣為1:10（g/ml），回流提取3次，每次2小時，溫度控制在80?℃，以去除黃酮、皂苷等小分子成分。接著，采用熱水回流提取法以料液比1:15（g/ml）進(jìn)行提取，回流時間為2小時，重復(fù)提取3次，溫度設(shè)置為100?℃。收集所得提取液后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在65℃下減壓濃縮，得到竹葉柴胡粗多糖提取物，并對其進(jìn)行烘干處理以去除水分。

5、（2）脫蛋白處理：將竹葉柴胡粗多糖溶解為0.08?g/ml的水溶液，加入2.5?%的中性蛋白酶（按溶液總體積計算），在50?℃下恒溫反應(yīng)1小時。在90?℃下處理10分鐘以滅活溶液中的中性蛋白酶，終止酶解反應(yīng)。隨后，離心并收集上清液。為了去除上清液中的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，采用sevage試劑法，進(jìn)行脫蛋白處理，向上清液中加入其體積1/4的sevage試劑（二氯甲烷:正丁醇?=?4:1），攪拌30分鐘后離心。棄去下層有機(jī)相及中間層的蛋白質(zhì)沉淀，收集上清液，此步驟重復(fù)五次，以保證蛋白順利去除。

6、（3）脫色素處理：稱取10?g脫蛋白竹葉柴胡粗多糖樣品，溶解于適量蒸餾水中。將其溶液平鋪在大孔樹脂層析柱的表面，靜置掛樣6小時。使用蒸餾水反復(fù)沖洗，直至洗脫液變?yōu)闊o色。此后，收集洗脫液并經(jīng)過減壓濃縮和透析處理，最后進(jìn)行干燥。

7、（4）分離純化：首先，使用deae-52纖維素柱對脫色素竹葉柴胡多糖進(jìn)行初步分離純化。取1g脫色素多糖樣品溶解于適量蒸餾水中，掛樣6小時，隨即使用不同濃度的nacl溶液（0.1-0.5?mol/l）緩慢洗脫。以1.0?ml/min的流速收集洗脫液，并使用苯酚硫酸法監(jiān)測多糖含量，根據(jù)洗脫曲線收集對稱峰。最終，合并濾液后進(jìn)行減壓濃縮、透析（3500?da）并干燥。接著，使用sephadex?g-200柱進(jìn)行進(jìn)一步純化。取100?mg各梯度竹葉柴胡多糖樣品，溶解于200?μl水中，掛樣2小時，并以蒸餾水進(jìn)行洗脫。利用苯酚-硫酸法測定多糖含量并繪制洗脫曲線，收集對稱峰后濃縮并干燥得到竹葉柴胡純多糖bmp-1。

8、（5）結(jié)構(gòu)表征：竹葉柴胡多糖bmp-1的分子量為15.76?kda。通過甲基化修飾、紅外光譜、核磁共振波譜（nmr）等手段分析表明，bmp-1主要由阿拉伯糖（ara）、鼠李糖（rha）、木糖（xyl）、半乳糖（gal）、葡萄糖（glc）、葡萄糖醛酸（glca）和半乳糖醛酸（gala）等單糖單元組成，摩爾百分比分別為：10.75?%、20.05?%、4.50?%、13.61?%、15.50?%、5.29?%、20.88?%。分析結(jié)果還揭示出，bmp-1的糖鏈結(jié)構(gòu)包含了12個糖殘基，且具有結(jié)構(gòu)片段α-d-galpa-6ome-(1→4)-β-d-glcp-(1→，α-d-galp-(1→4)-α-d-galp-(1→和?→4)-α-l-rhap-?(1→3)-α-l-rhap-(1→。與此同時發(fā)現(xiàn)，竹葉柴胡多糖bmp-1隨著分子量的不斷增大結(jié)構(gòu)也變得更加緊密，且具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

9、（6）生物活性：體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，bmp-1對dpph、abts和羥基自由基均具有一定的清除能力。在最大濃度下，bmp-1對dpph自由基清除能力為44.57?%，abts自由基清除能力為44.13?%，羥基自由基清除能力為67.19?%。

10、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果：

11、本發(fā)明體外抗氧化活性結(jié)果表明竹葉柴胡多糖具有較好的抗氧化活性。當(dāng)多糖樣品bmp-1濃度達(dá)到5.0?mg/ml時，dpph自由基的清除效果為44.57?%；在該加藥濃度下，bmp-1對abts自由基的清除效果為44.13?%。與此同時，bmp-1也具有一定的羥基自由基清除活性，在最大濃度時羥基自由基清除能力可達(dá)67.19?%。這些結(jié)果表明，竹葉柴胡多糖bmp-1在抗氧化活性方面具有潛在的應(yīng)用價值，尤其是在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的預(yù)防和治療中，具有良好的發(fā)展前景。

技術(shù)特征：

1.具有抗氧化活性的竹葉柴胡多糖制備方法，其特征在于，所述方法包括以下制備過程：

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有抗氧化活性的竹葉柴胡多糖制備方法，其特征在于，所述制備的bmp-1，根據(jù)甲基化分析，紅外光譜，一維、二維核磁共振波譜數(shù)據(jù)分析可知主鏈結(jié)構(gòu)為：α-d-galpa-6ome-(1→4)-β-d-glcp-(1→，α-d-galp-(1→4)-α-d-galp-(1→和?→4)-α-l-rhap-(1→3)-?α-l-rhap-(1→。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有抗氧化活性的竹葉柴胡多糖制備方法，其特征在于，所述制備的均一竹葉柴胡多糖，通過體外dpph、abts和羥基自由基的清除作用評價其體外抗氧化活性。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明一種竹葉柴胡多糖(BMP?1)的制備方法，涉及一種植物多糖的提取、分離和純化工藝方法。該方法首先通過石油醚、90%乙醇和熱水回流提取法從竹葉柴胡中得到粗浸膏。然后，對浸膏進(jìn)行去蛋白和脫色處理，去除雜質(zhì)。接著，采用DEAE?52纖維素柱層析法進(jìn)行初步分離，以富集多糖組分。最后，使用Sephadex?G?200凝膠進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到高純度竹葉柴胡多糖BMP?1。進(jìn)一步通過甲基化分析結(jié)合氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法，表明竹葉柴胡多糖中主鏈結(jié)構(gòu)包含片段α?D?GalpA?6OMe?(1→4)?β?D?Glcp?(1→，α?D?Galp?(1→4)?α?D?Galp?(1→和→4)?α?L?Rhap?(1→3)?α?L?Rhap?(1→。體外DPPH、ABTS和羥基自由基清除活性結(jié)果表明，竹葉柴胡多糖BMP?1具有一定的抗氧化活性。

技術(shù)研發(fā)人員：李丹琦,劉學(xué)貴,高品一,馬珊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：沈陽化工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15