本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)，特別是涉及一種基于微滴數(shù)字pcr技術(shù)精準(zhǔn)閾值判定耐除草劑基因棉花新品種百分含量的方法構(gòu)建及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、伴隨轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物及其衍生食品的安全問(wèn)題受到世界各個(gè)國(guó)家、組織和地區(qū)的強(qiáng)烈關(guān)注，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的上市和推廣規(guī)定了明確的政策和法規(guī)。我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物的標(biāo)識(shí)制度也在不斷地完善并與國(guó)際接軌，《關(guān)于修改農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法的決定（征求意見(jiàn)稿）》，擬將轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)閾值設(shè)定為3%，即單一作物轉(zhuǎn)基因成分含量超過(guò)產(chǎn)品3%時(shí)應(yīng)當(dāng)標(biāo)識(shí)。轉(zhuǎn)基因閾值，即轉(zhuǎn)基因檢測(cè)閾值（threshold?of?transgenepresence），是指檢測(cè)生物產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分時(shí)，按法規(guī)要求容許檢測(cè)到的轉(zhuǎn)基因成分的規(guī)定含量，超出該含量的生物產(chǎn)品則被判定為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。

2、為了配套轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)閾值的發(fā)布實(shí)施，亟需科學(xué)、快速、精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因成分含量判定方法。目前，實(shí)時(shí)熒光定量pcr是常用的外源基因百分含量判定方法,?已用于轉(zhuǎn)基因及其制品成分檢測(cè)領(lǐng)域，然而，該方法在百分含量判定中需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，是一種相對(duì)定量方法，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量易受到dna純度、引物和探針的濃度、反應(yīng)抑制因子等諸多因素影響，因此實(shí)時(shí)熒光定量pcr判定外源基因百分含量會(huì)存在一定的局限性，尤其是在缺少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)樣品的前提下，局限性更為突出。而微滴式數(shù)字pcr（droplet-based?digitalpcr，dd?pcr）是新興的一種核酸絕對(duì)定量檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)不依賴(lài)任何校準(zhǔn)物，無(wú)需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以形成大量油包水微滴的形式對(duì)核酸進(jìn)行成千上萬(wàn)倍稀釋?zhuān)缓笠悦總€(gè)小微滴為獨(dú)立的反應(yīng)單元進(jìn)行pcr反應(yīng)，最后利用泊松分布原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸檢測(cè)的絕對(duì)定量。相比其他方法，工作量小、周期短、操作要求低、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，已逐步成為檢測(cè)外源基因百分含量的首選方法。

3、耐除草劑棉花ggk2由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花品系r18獲得，通過(guò)共表達(dá)2個(gè)不同作用機(jī)制的耐草甘膦基因?gr79?epsps?和?gat，進(jìn)一步獲得了高抗草甘膦、低殘留的性狀。其中g(shù)r79?epsps蛋白對(duì)草甘膦分子親和能力低，可以克服除草劑的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，從而避免草甘膦除草劑對(duì)植物的致死效應(yīng)；gat?蛋白可以乙?；莞熟Ⅳ然纬蔁o(wú)毒的乙?；莞熟?，從而增強(qiáng)棉花ggk2草甘膦耐受性，最終培育獲得了抵抗草甘膦除草劑濃度最高可以達(dá)到8倍生產(chǎn)應(yīng)用濃度的品系，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究以耐除草劑棉花ggk2的5’端轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶標(biāo)，以 adhc為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，通過(guò)引物探針篩選、特異性測(cè)試等建立了微滴數(shù)字pcr閾值判定方法，旨在為該轉(zhuǎn)化體的安全評(píng)價(jià)、行政監(jiān)管和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供重要的技術(shù)支撐。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明克服了實(shí)時(shí)熒光定量pcr的外源基因百分含量分析技術(shù)依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的缺陷，提供了一種快速、簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)判定耐除草劑棉花ggk2轉(zhuǎn)化體特異性序列百分含量的方法。本發(fā)明的目的是建立轉(zhuǎn)基因棉花新品系ggk2微滴數(shù)字pcr轉(zhuǎn)化體含量分析方法，該方法較其他方法具有工作量小、周期短、操作要求低、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)。

2、本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容如下：

3、一種耐除草劑棉花ggk2的精準(zhǔn)閾值判定方法的引物及探針，其特征在于包括5’端轉(zhuǎn)化體特異性序列：

4、正向引物序列：5’-?ggttgaggaggtttgttatttatttgt?-3’

5、反向引物序列：5’-?ctcccttaattctccgctcat?-3’

6、探針序列：fam-?cagattgtcgtttcccgccttc?-bhq1；

7、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 adhc基因序列：

8、正向引物序列：5’-?cacatgacttagcccatctttgc?-3’

9、反向引物序列：5’-?cccacccttttttggtttagc?-3’

10、探針序列：hex-?tgcaggttttggtgccactgtgaatg?-bhq1。

11、本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了用于精準(zhǔn)閾值判定耐除草劑棉花ggk2百分含量的方法，其特征在于如下步驟：

12、（1）5’端轉(zhuǎn)化體特異性序列：

13、正向引物序列：5’-?ggttgaggaggtttgttatttatttgt?-3’

14、反向引物序列：5’-?ctcccttaattctccgctcat?-3’

15、探針序列：fam-?cagattgtcgtttcccgccttc?-bhq1；

16、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 adhc基因序列：

17、正向引物序列：5’-?cacatgacttagcccatctttgc?-3’

18、反向引物序列：5’-?cccacccttttttggtttagc?-3’

19、探針序列：hex-?tgcaggttttggtgccactgtgaatg?-bhq1。

20、（2）pcr反應(yīng)體系：總體積為20?μl，包括bio-rad?ddpcr?supermix?for?probes?10μl，10?μmol/l上游引物0.8?μl，10?μmol/l下游引物0.8?μl，10?μmol/l探針0.4?μl，25～50ng/μl?dna模板1.0?μl，最終用無(wú)菌水補(bǔ)充至20?μl；

21、（3）微滴生成：將20?μl反應(yīng)體系小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，避免產(chǎn)生氣泡，同時(shí)與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入微滴生成油70?μl，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后用移液器傾斜30～45度吸取40?μl反應(yīng)產(chǎn)物，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字96孔反應(yīng)板中，170℃熱封膜；

22、（4）pcr反應(yīng)程序：94?℃預(yù)變性熱激活10?min，1個(gè)循環(huán)；94?℃變性30?s，58?℃退火1?min，40個(gè)循環(huán)；98℃酶失活10?min，1個(gè)循環(huán)；

23、（5）結(jié)果分析：微滴數(shù)字pcr儀自動(dòng)計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的拷貝數(shù)濃度、總微滴數(shù)和陽(yáng)性微滴數(shù)，總微滴數(shù)大于10000以上視為有效結(jié)果，按照公式a=b/c*100%，計(jì)算出試樣中耐除草劑棉花ggk2的轉(zhuǎn)基因成分百分含量，用于轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)閾值的科學(xué)判定；公式中a為耐除草劑棉花ggk2轉(zhuǎn)化體含量，b為耐除草劑棉花ggk2轉(zhuǎn)化體特異性序列的拷貝數(shù)濃度，c為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 adhc的拷貝數(shù)濃度。

24、本發(fā)明更進(jìn)一步公開(kāi)了用于判定耐除草劑棉花ggk2轉(zhuǎn)化體含量的特異性引物及探針在用于微滴數(shù)字pcr技術(shù)快速高效判定耐除草劑棉花ggk2標(biāo)識(shí)閾值方面的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法大大提高了工作效率，具有快速、靈活、高效、所需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，可快捷簡(jiǎn)便高效的用于對(duì)耐除草劑棉花ggk2品系定量分析及標(biāo)識(shí)閾值限判定，并可為其他轉(zhuǎn)基因棉花品系及其他轉(zhuǎn)基因作物的微滴式數(shù)字pcr定量分析及標(biāo)識(shí)閾值判定提供參考。

25、本發(fā)明主要考察了微滴數(shù)字pcr技術(shù)分析耐除草劑棉花ggk2轉(zhuǎn)化體含量的引物探針的特異性和微滴的擴(kuò)增效果，重點(diǎn)是解決耐除草劑棉花ggk2新品系的標(biāo)識(shí)閾值精準(zhǔn)判定，為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法的實(shí)施和監(jiān)管提供技術(shù)支撐，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于首次建立了微滴數(shù)字pcr方法精準(zhǔn)判定耐除草劑棉花新品系ggk2轉(zhuǎn)化體特異性序列百分含量的方法，為轉(zhuǎn)基因棉花新品系成分含量檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)手段。

26、本發(fā)明試驗(yàn)效果如下：

27、（1）以轉(zhuǎn)基因棉花混合樣、轉(zhuǎn)基因玉米混合樣、轉(zhuǎn)基因大豆混合樣、轉(zhuǎn)基因油菜混合樣、轉(zhuǎn)基因水稻混合樣和非轉(zhuǎn)基因棉花的基因組dna為模板，對(duì)5’端轉(zhuǎn)化體特異性引物，進(jìn)行微滴數(shù)字pcr擴(kuò)增。結(jié)果見(jiàn)圖1，只有以耐除草劑棉花ggk2基因組dna為模板時(shí)生成有陽(yáng)性微滴，而以其他轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因棉花基因組dna為模板時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到陽(yáng)性微滴生成，表明本檢測(cè)方法的特異性良好。

28、（2）以100%耐除草劑棉花ggk2的基因組dna為模板，以棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 adhc為參照基因，應(yīng)用構(gòu)建的微滴數(shù)字pcr標(biāo)識(shí)閾值判定體系，進(jìn)行微滴數(shù)字pcr分析，測(cè)定轉(zhuǎn)化體特異性引物的拷貝數(shù)濃度。結(jié)果見(jiàn)圖2，棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 adhc和5’端轉(zhuǎn)化體特異性序列的拷貝數(shù)濃度分別為556?copies/μl和542?copies/μl，計(jì)算出試樣中耐除草劑棉花ggk2的轉(zhuǎn)化體百分含量為97.48%。

29、（3）計(jì)算試樣中耐除草劑棉花ggk2轉(zhuǎn)化體含量

30、將耐除草劑棉花ggk2轉(zhuǎn)化體特異性序列的拷貝數(shù)濃度和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 adhc的拷貝數(shù)濃度帶入公式，計(jì)算出試樣中耐除草劑棉花ggk2的轉(zhuǎn)化體特異性序列百分含量。計(jì)算試樣中耐除草劑棉花ggk2轉(zhuǎn)化體含量的公式：

31、a=b/c*100%，

32、式中：

33、a—試樣中耐除草劑棉花ggk2的轉(zhuǎn)化體含量；

34、b—耐除草劑棉花ggk2的轉(zhuǎn)化體特異性序列拷貝數(shù)濃度；

35、c—內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 adhc拷貝數(shù)濃度。

36、試驗(yàn)結(jié)論：

37、本研究建立了微滴式數(shù)字pcr分析耐除草劑棉花ggk2轉(zhuǎn)化體含量的方法。該方法以耐除草劑棉花ggk2新品系的5’端轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶序列，設(shè)計(jì)了pcr擴(kuò)增引物和taqman探針，并對(duì)引物探針特異性進(jìn)行了鑒定，同時(shí)以棉花內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因 adhc為參照，建立了微滴式數(shù)字pcr轉(zhuǎn)化體含量檢測(cè)體系。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，只有以耐除草劑棉花ggk2基因組dna為模板才有擴(kuò)增信號(hào)；用100%耐除草劑棉花ggk2基因組dna，進(jìn)行外源目的基因5’端轉(zhuǎn)化體特異性序列的微滴數(shù)字pcr擴(kuò)增，耐除草劑棉花ggk2的轉(zhuǎn)化體特異性序列百分含量為97.48%。結(jié)果表明本研究建立的耐除草劑棉花ggk2百分含量分析方法工作量小、周期短、操作要求低、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可快捷精準(zhǔn)的用于對(duì)耐除草劑棉花ggk2新品系的百分含量分析，并可為其他轉(zhuǎn)基因棉花品系及其他轉(zhuǎn)基因作物的微滴式數(shù)字pcr轉(zhuǎn)化體含量分析方法建立提供參考。