本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域。具體地說，本發(fā)明涉及用于老年相關性黃斑變性的治療的基因治療藥物。

背景技術：

1、老年相關性黃斑變性(age-related?macular?disease,amd)是目前危害視覺健康的重大公共衛(wèi)生問題。年齡是amd的首要危險因素。綜合藍山眼科研究所、beaver?dam眼科研究所、rotterdam研究中心的研究發(fā)現，在55-64歲、65-74歲、75-84歲以及85歲以上人群中，新生血管性(濕性)老年相關性黃斑變性(namd)發(fā)病率分別為0.17％、0.54％、2.52％和5.76％(smith?et?al.2001)。在中國，50歲以上人群中amd的患病率為15.5％。隨著人口老齡化的加劇以及眼底病篩查手段的進步，中國namd患者由1990年的171萬人增至2015年的381萬人，預計2050年將達到884萬人(中國年齡相關性黃斑變性的臨床路徑.2013；song?etal.2017)。

2、針對namd的基因治療的現有技術大多使用腺相關病毒(adeno-associatedvirus,aav)載體攜帶抗-vegf(vascular?endothelial?growth?factor)分子的表達盒進行眼內注射。但表達元件和其他調控元件和抗vegf分子的搭配，以及具有不同轉導效率和細胞組織嗜性的aav載體和注射方式的組合都可能會影響治療藥物的效果和安全性。

3、目前已批準的抗vegf藥物的治療方案通常包括開始3個月的負荷階段，以及隨后的維持階段。其中維持階段包括每月一次、每2個月一次或每3個月一次的固定治療方案、“按需”(prn)方案及“治療-延長”(t&e)方案等，均需要患者定期隨訪，多次注射，對患者依從性要求較高，給患者和醫(yī)療服務者帶來了較大負擔(mitchell?et?al.2018；羅曼等.2020)。

4、現有技術經常會使用較強的廣譜啟動子cmv(參見如preclinical?evaluation?ofadvm-022,a?novel?gene?therapy?approach?to?treating?wet?age-related?maculardegeneration,doi:10.1016/j.ymthe.2018.11.003.，以下簡稱“advm-022”)，但在靈長類和臨床實驗中，cmv啟動子存在被沉默的風險，對眼部的光感受器和視網膜色素上皮細胞存在一定的毒性。

5、同時，現有技術公開的血清型一般是aav2、aav8和aav2.7m8(參見如advm-022，或如delivery?of?nvegfi?using?aav8?for?the?treatment?of?neovascular?age-relatedmacular?degeneration,doi:10.1016/j.omtm.2022.01.002.，以下簡稱“nvegfi”)。其中，野生型aav2和aav8無法高效穿透視網膜的內界膜(inner?limiting?membrane,ilm)到達大多類型namd病灶的主要細胞組織(rpe和pr)，所以一般采用視網膜下腔給藥的方式，這種給藥方式雖然可以有效遞送目的基因，但對臨床手術的要求較高。在采取玻璃體腔給藥(臨床的難度交底，患者隨從性更好)的途徑下，這兩款野生型aav載體會導致大部分raav和表達的抗vegf分子殘留在玻璃體腔液中，可能會影響臨床治療效果。而advm-022技術中公開的aav2.7m8比野生型aav2有較好的視網膜穿透力，可以用于玻璃體腔注射；但在轉導效率和細胞嗜性方面仍存在可優(yōu)化的空間。

6、因此，本領域需要開發(fā)一種能夠便于給藥，能夠高效遞送和表達目的基因的基因治療藥物，用于老年相關性黃斑變性的治療。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的就是提供用于老年相關性黃斑變性治療的能夠高效遞送和表達目的基因的基因治療藥物。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種抗vegf融合蛋白，所述融合蛋白從n端到c端具有式i結構：

3、l-v-h-fc(i)

4、式中，各“-”獨立地為鍵或連接肽；

5、l為分泌信號肽，所述分泌信號肽來源于ig?kappa鏈；

6、v為抗vegf蛋白，所述的抗vegf蛋白包括vegfr1(vegf?recptor?1)的igc結構域2和vegfr2的igc結構域3；

7、h為任選的鉸鏈區(qū)；

8、fc為任選的免疫球蛋白可結晶片段。

9、在另一優(yōu)選例中，所述分泌信號肽的序列如seq?id?no:11所示。

10、在另一優(yōu)選例中，所述v的序列如seq?id?no:3第1-202位所示。

11、在另一優(yōu)選例中，所述的鉸鏈區(qū)氨基酸序列為gpg。

12、在另一優(yōu)選例中，所述的fc為人igg1的fc片段。

13、在另一優(yōu)選例中，所述的抗vegf融合蛋白還包括ha標簽。

14、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達盒，所述表達盒包含編碼如本發(fā)明第一方面所述抗vegf融合蛋白的核酸分子。

15、在另一優(yōu)選例中，所述表達盒從5’-3’端具有式ii結構：

16、z0-z1-z2-z3-z4-z5(ii)

17、式中，各“-”獨立地為鍵或核苷酸連接序列；

18、z0為無或5'itr序列；

19、z1為啟動子；

20、z2為內含子；

21、z3為編碼如本發(fā)明第一方面所述的抗vegf融合蛋白的核苷酸序列；

22、z4為無或hghpa(human?growth?hormone?poly(a)tail)序列；

23、z5為無或3'itr序列。

24、在另一優(yōu)選例中，所述z3的核苷酸序列如seq?id?no:4所示，或與seq?id?no:4所示核苷酸序列具有≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％或≥99％的序列同一性。

25、在另一優(yōu)選例中，所述的啟動子包括組織特異性啟動子。

26、在另一優(yōu)選例中，所述啟動子選自下組：ubc(ubiquitin?c)啟動子、cag啟動子、或其組合。

27、在另一優(yōu)選例中，所述的ubc啟動子序列如seq?id?no:5所示。

28、在另一優(yōu)選例中，所述的cag啟動子序列如seq?id?no:6所示。

29、在另一優(yōu)選例中，所述的內含子選自下組：ubc-cag嵌合內含子、cag內含子、ubc內含子、或其組合。

30、在另一優(yōu)選例中，所述ubc-cag嵌合內含子序列如seq?id?no:7所示。

31、在另一優(yōu)選例中，所述ubc內含子序列如seq?id?no:8所示。

32、在另一優(yōu)選例中，所述cag內含子序列如seq?id?no:9或seq?id?no:10所示。

33、在另一優(yōu)選例中，各個核苷酸連接序列的長度為0-30nt，較佳地0-15nt。

34、在另一優(yōu)選例中，所述表達盒的核苷酸序列如seq?id?no:2所示，或與seq?id?no:2所示核苷酸序列具有≥85％、≥90％、≥95％、≥97％、≥98％或≥99％序列同一性。

35、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有如本發(fā)明第二方面所述的表達盒。

36、在另一優(yōu)選例中，所述載體還含有額外的一個或多個啟動子、增強子、內含子、轉錄終止信號、多腺苷酸化序列、復制起點、選擇性標記、核酸限制性位點和/或同源重組位點連接。

37、在另一優(yōu)選例中，所述的選擇性標記包括抗性標記和熒光素標記，較佳地，所述的選擇性標記為卡那霉素抗性序列。

38、在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括質粒、病毒載體。

39、在另一優(yōu)選例中，所述的質粒為穿梭質粒。

40、在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括dna病毒、逆轉錄病毒載體。

41、在另一優(yōu)選例中，所述的載體選自下組：慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體(aav)、或其組合；較佳地，所述載體為aav載體。

42、在另一優(yōu)選例中，所述載體用于表達如本發(fā)明第一方面所述的抗vegf融合蛋白。

43、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種腺相關病毒(aav)載體，所述腺相關病毒載體含有如本發(fā)明第二方面所述的表達盒。

44、在另一優(yōu)選例中，所述腺相關病毒的血清型選自下組：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav2-aav3、aavrh.10、aavhu.14、aav3a/3b、aavrh32.33、aavhsc15、aav-hsc17、aavhu.37、aavrh.8、cht-p6、aav2.5、aav6.2、aav2i8、aav-hsc15/17、aavm41、aav9.45、aav6(y445f/y731f)、aav2.5t、aav-hae1/2、aavclone?32/83、aavshh10、aav2(y->f)、aav8(y733f)、aav2.15、aav2.4、aavm41、aavr3.45、aav2或aav5、或其組合。

45、在另一優(yōu)選例中，所述的aav載體為aav2載體或aav9載體。

46、在另一優(yōu)選例中，所述的aav載體為改造的aav載體。

47、在另一優(yōu)選例中，所述改造的aav載體的衣殼蛋白vp1相對于野生型aav9衣殼蛋白vp1，第584-598位氨基酸替換為lqrgnrqaatadvnt(seq?id?no:17)。

48、在另一優(yōu)選例中，所述改造的aav載體衣殼蛋白包含插入的功能肽。

49、在另一優(yōu)選例中，所述插入的功能肽具有選自下組的功能：

50、1)增強aav衣殼蛋白變體的組織特異靶向性；

51、2)改變野生型aav衣殼蛋白的受體結合基序空間結構；或

52、3)弱化野生型aav衣殼蛋白與半乳糖(glu)的結合活性。

53、在另一優(yōu)選例中，所述的功能肽包含如lalgdvtrpa(seq?id?no:18)所示的氨基酸序列。

54、在另一優(yōu)選例中，所述的功能肽插入到對應野生型aav衣殼蛋白vp1氨基酸序列的第586位和587位之間、第587位和588位之間、或第588位和589位之間。

55、在另一優(yōu)選例中，所述改造的aav載體衣殼蛋白的vp1相對于野生型aav9衣殼蛋白vp1具有以下突變：第584-598位氨基酸替換為如lqrgnlalgdvtrparqaatadvnt(seq?id?no:19)所示的序列。

56、在另一優(yōu)選例中，所述改造的aav載體衣殼蛋白的vp1相對于野生型aav衣殼蛋白vp1具有以下突變：

57、a)第240位異亮氨酸i突變?yōu)樘K氨酸t(yī)(i240t)；

58、b)第708位纈氨酸v突變?yōu)楫惲涟彼醝(v708i)；

59、c)第444位酪氨酸y突變?yōu)楸奖彼醘(y444f)；

60、d)上述a)-c)的任意組合。

61、在另一優(yōu)選例中，所述改造的aav載體衣殼蛋白的vp1相對于野生型aav衣殼蛋白vp1具有以下突變：i240t、v708i。

62、在另一優(yōu)選例中，所述改造的aav載體衣殼蛋白的氨基酸序列選自下組：

63、(i)如seq?id?no:13或15所示的序列；

64、(ii)與seq?id?no:13或15所示的氨基酸序列至少有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。

65、在另一優(yōu)選例中，所述aav載體用于治療眼部疾病。

66、在另一優(yōu)選例中，所述改造的aav載體相對于對應的野生型aav載體，感光細胞嗜性至少提升1個數量級，優(yōu)選2個數量級。

67、在另一優(yōu)選例中，所述改造的aav載體對內界膜的穿透力高于對應的野生型aav載體。

68、在另一優(yōu)選例中，所述改造的aav載體相對于對應的野生型aav載體，內界膜穿透力提升至少15％，優(yōu)選提升至少25％，更優(yōu)選提升至少35％。

69、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有本發(fā)明第三方面所述的載體或本發(fā)明第四方面所述的aav載體，或其染色體中整合有外源的如本發(fā)明第二方面所述的表達盒。

70、在另一優(yōu)選例中，所述宿主細胞為哺乳動物細胞，所述哺乳動物包括人和非人哺乳動物。

71、在另一優(yōu)選例中，所述宿主細胞選自下組：hek細胞、感光細胞(包括視錐細胞和/或視桿細胞)、其他視覺細胞(如雙極細胞、水平細胞)、神經節(jié)細胞、或其組合。

72、在另一優(yōu)選例中，所述宿主細胞選自下組：視桿細胞、視錐細胞、給光雙極細胞、撤光雙極細胞、水平細胞、神經節(jié)細胞、無長突細胞、或其組合。

73、在本發(fā)明的第六方面，提供了一種本發(fā)明第三方面所述的載體或本發(fā)明第四方面所述的腺相關病毒載體的用途，用于制備一制劑或組合物，所述制劑或組合物用于治療vegf相關眼部疾病。

74、在另一優(yōu)選例中，所述制劑或組合物還用于抑制眼內vegf表達。

75、在另一優(yōu)選例中，所述制劑或組合物還用于減輕激光損傷導致的滲漏和/或抑制血管新生。

76、在另一優(yōu)選例中，所述vegf相關眼部疾病選自下組：黃斑變性、糖尿病視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變或其組合。

77、在另一優(yōu)選例中，所述黃斑變性為年齡相關性黃斑變性，更佳地為濕性年齡相關性黃斑變性。

78、在本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物制劑，所述的制劑含有(a)本發(fā)明第三方面所述的載體或本發(fā)明第四方面所述的腺相關病毒載體，以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。

79、在另一優(yōu)選例中，所述藥物制劑的劑型選自下組：凍干制劑、液體制劑、或其組合。

80、在另一優(yōu)選例中，所述藥物制劑中載體的含量為1×109-1×1016個病毒/毫升，較佳地1×1012-1×1013個病毒/毫升。

81、在另一優(yōu)選例中，所述藥物制劑用于治療vegf相關眼部疾病。

82、在另一優(yōu)選例中，所述vegf相關眼部疾病選自下組：黃斑變性、糖尿病視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變或其組合。

83、在另一優(yōu)選例中，所述黃斑變性為年齡相關性黃斑變性，更佳地為濕性年齡相關性黃斑變性。

84、在本發(fā)明的第八方面，提供了一種治療方法，所述方法包括將本發(fā)明第三方面所述的載體或本發(fā)明第四方面所述的腺相關病毒載體施用于需要的對象。

85、在另一優(yōu)選例中，所述的施用選自下組：靜脈內施用、肌內施用、皮下施用、口服施用、粘膜接觸、腹膜內施用、病灶內施用、或其組合。

86、在另一優(yōu)選例中，將所述腺相關病毒載體注射到需要的對象的眼睛內。

87、在另一優(yōu)選例中，所述的注射包括視網膜下腔注射、脈絡膜上注射、玻璃體腔注射；較佳地為玻璃體腔注射。

88、在另一優(yōu)選例中，所述需要的對象包括人和非人哺乳動物。

89、在另一優(yōu)選例中，所述治療方法為治療vegf相關眼部疾病的方法。

90、在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括向所述對象施用免疫調節(jié)劑。

91、在另一優(yōu)選例中，所述的方法中，每次以1×106-1×1016vg/眼的劑量施用所述載體，較佳地1×107-1×108vg/眼。

92、在本發(fā)明的第九方面，提供了一種如本發(fā)明第一方面所述的抗vegf融合蛋白的制備方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明第五方面所述的宿主細胞，從而得到抗vegf融合蛋白。

93、應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。